内源逆转录病毒来源的endo-siRNAs对猪早期胚胎发育的影响

发布时间：2020-05-14 12:16

【摘要】：内源小干扰RNA(endo-siRNA)是近年来在哺乳动物生殖细胞中发现的一类新型小RNA,长度一般为20-22nt,能与AGO2蛋白结合,参与RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用。Endo-siRNA的前体是双链RNA(dsRNA),dsRNA在DICER的切割下产生endo-siRNA。目前研究表明,endo-siRNAs的来源包括转座子、互补转录物和长发夹结构RNA(long hairpin RNA)等。内源逆转录病毒(endogenous retrovirus,ERV)是一类重要的转座子,在人类和小鼠基因组中分别占8%和10%,其对人和小鼠胚胎早期发育起到重要的调控作用。ERV侧翼具有长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)结构,具有启动子和终止子的作用,其转录产物能形成dsRNA,可产生endo-siRNA。在本实验室的前期工作中,采用小RNA高通量深度测序技术,在猪合子中鉴定了大量endo-siRNAs。在本研究中,我们主要探索LTR来源的endo-siRNAs(LTR-siRNAs)对猪早期胚胎发育的影响。我们首先通过stem loop RT-PCR对高通量测序结果进行验证,结果表明我们关注的LTR-siRNAs在猪合子中都有表达。在MII期卵母细胞中注射DICER的锁核酸(LNA-iDICER),对Dicer进行有效敲低,发现LTR-siRNAs表达量也显著下降,说明LTR-siRNAs的形成依赖于DICER。Endo-siRNAs来源于dsRNA,RNaseA处理可以降解单链RNA,但不影响dsRNA。设计LTR的荧光探针,进行RNA荧光原位杂交实验(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测,结果在RNaseA处理组的胚胎中获得较强的荧光信号,表明LTR的转录产物可形成双链。进一步发现,通过注射LNA-iLTRs敲低合子期LTRs的表达水平,LTR-siRNAs的表达量也显著下降,说明LTR-siRNAs来源于LTRs转录产物形成的dsRNA。为了阐述LTR-siRNAs在猪胚胎早期发育过程中对靶LTRs的调控作用,我们首先通过real-time PCR检测猪早期胚胎发育各个时期LTRs和LTR-siRNAs的表达模式,结果表明在猪早期胚胎发育各时期LTR-siRNAs对LTRs的表达具有抑制作用。这一现象进一步通过在MII期卵母细胞中注射LTR-siRNAs的模拟物(mimics)和阻抑物(inhibitors)得到验证。最后,我们通过在MII期卵母细胞中注射LTR-siRNAs的mimics和inhibitors以及LTR锁核酸(LNA-iLTRs),检测LTR-siRNAs及其靶LTRs对猪早期胚胎发育的影响。结果显示,与对照组相比,LTR-siRNAs mimics和inhibitors及LNA-iLTRs注射组卵裂率、囊胚率都显著下降,表明LTR-siRNAs通过调控靶LTRs的表达水平对猪胚胎早期发育具有显著的调控作用。
【图文】：

图 1 果蝇、小鼠中 endo-siRNA 的生物发生过程e 1 The endogenetic process of endo-siRNA in drosopHila melanogaster an-siRNA 的来源

图 2 endo-siRNA 的来源Figure 2 Source of endo-siRNAs.4.1 Endo-siRNA 来源于转座子转座子的插入能引起基因组的突变，，因此需要强有力的机制限制转座子的活性。在生
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828

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本文编号：2663336