空肠弯曲杆菌感染肝脏中抗生素抗性基因的时空分布

发布时间：2020-05-14 12:50

【摘要】：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)作为在世界范围内广泛流行的重要食源性致病菌和共生菌,主要导致人或动物胃肠炎、心内膜炎、败血症等,能引发其免疫损伤性疾病(反应性关节炎、肝炎和格林-巴利综合征(GBS)等)。抗生素抗性基因(ARGs)能借助抗性元件进行迁移而被人体正常菌群、机会致病菌和病原菌所捕获,而携带有ARGs的病原菌感染人体,将可能难以被治疗,甚至无药可救。当前对多重耐药的空肠弯曲杆菌研究十分有必要。基于课题组前期对华中地区家禽空肠弯曲菌流行病学的研究,表明空肠弯曲杆菌菌株(ST464CCs克隆群)形成生物膜的能力最强,且对各类抗生素的耐药性整体偏高。然而,多重耐药的空肠弯曲杆菌在感染脏器后的慢性感染过程中,引起抗生素抗性基因(ARGs)是否传递给机体内其他细菌的过程不清楚。本研究提出假设:多重耐药的空肠弯曲杆菌感染肝脏慢性感染过程中,可引起ARGs传递给肝脏中的细菌,并引起微生物群落结构改变。设计试验如下:将80只昆明鼠随机分成A、B、C、D四组,依次接种6×10~9CFU/ml、3×10~9 CFU/ml、1.5×10~9CFU/ml的菌液和布什肉汤,整个感染性试验持续八周。通过观察临床症状、统计临床积分、计算脏器指数、剖检病理变化、病理切片、病理积分等相关性分析及致病性资料来有效评估自身免疫性病理损伤模型,探究肝脏损伤的特征性变化;通过微生物qPCR DNA芯片检测ARGs的种类;构建intI1、tnpA、16S rRNA克隆文库,结合qPCR对ARGs进行丰度定量,探究ARGs在肝脏呈现出的时空分布特征;利用16S rRNA巢式PCR扩增及高通测序技术手段对肝脏样品中微生物群落进行分析,揭示ARGs在机体肝脏内的迁移方式和ARGs分布特征。主要的研究结果如下:(1)空肠弯曲杆菌感染昆明鼠自身免疫性损伤病理模型的建立。据实验所得最佳建模条件,实验设定每周一到周天上午八点和下午六点对各组鼠观察,A组高浓度、B组中浓度菌液剂量感染昆明鼠后,表现出活动力减弱、呼吸出现急促、身体略微颤抖、双后肢行动弱、腹部皮毛凌乱等临床上的症状,比C组的低剂量浓度感染的临床症状明显,临床症状评分可达4-5分。低剂量组的昆明鼠轻微脱毛现象,未见明显活动异常,临床症状评分为0分。每周二上午八点定时对各浓度组昆明鼠剖检,其剖检主要病变是在肠系膜处,小肠有积液;肝、脾脏与对照组对比有明显肿大,有炎症,与临床上感染症状是相符合的;组织病理切片显示在肝上的中央静脉排列不规整,肝细胞内有损伤病变,盲肠区域,黏膜有轻微的坏死脱落,其固有层显示充血。实验结果表明空肠弯曲杆菌ST464对昆明鼠进行腹腔接种不同剂量后,引起不同时间点脏器指数显著的特征性变化,特别脾脏及肝脏表现出的明显特征性变化,小肠的特征性轻微明显;而心脏、肺、肾脏等没有表现出明显的特征性变化,这极可能与各器官的功能作用有很大关系。通过免疫损伤性病理模型,引起了昆明鼠肝脏的弥散性慢性感染。(2)空肠弯曲杆菌感染肝脏中抗生素抗性基因在不同浓度和不同时间点的分布特征。在实验室条件下,根据高中低三个浓度的菌液和布什肉汤(对照组)对昆明鼠攻毒且连续八周时间取样分析。利用微生物qPCR DNA芯片共检测出10种耐药基因,分属为β-内酰胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类三大类抗生素的抗性基因,占比分别是73.97%、23.25%、2.77%。由Sperman相关系数分析,int/tnpA丰度呈现正向显著性关系,p0.05;整合子intI1基因和tnpA在ARGs的传播过程中,对ARGs捕获及其水平转移的起关键性的作用;抗性基因ermB与肝脏指数(Liver index)呈现正向显著性关系,p0.05;即分析ermB基因在慢性感染过程中,对肝脏的病理变化有明显的作用。放线菌门(Actinobacteria)与SHV(β-内酰胺类抗生素抗性基因)呈现正向显著性关系。通过Adonis分析,R~2=0.49531表示分组对差异的解释度越高;P0.02,说明本次检验的可信度高,大多数相近的样品之间微生物群落结构相似度是相对较高的。由16S rRNA Miseq高通量测序结果表明,在三组高中低浓度多重耐药的空肠弯曲杆菌感染过程中,在微生物群落的门水平上物种类别,变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)在微生物群落中作为最主要的菌群,其丰度分别是38.73%、33.23%、19.7%,占微生物总量的91.66%,其他物种的差异不是很明显;在微生物群落的属水平上,红球菌属(Rhodococcus)、无色杆菌属(Achromobacter)、葡萄球菌(Staphylococcus)有表明是作为共同的优势属类,除了优势属类外,其他物种变化有一定差异。高浓度组的多重耐药的空肠弯曲杆菌对机体的慢性感染过程中,会在一定程度上降低其微生物的多样性和丰度,这可能就是在微生物群落中一定程度上能对抗性优势菌群的生长繁殖有促进作用。综上,本研究对多重耐药的空肠弯曲杆菌ST464感染肝脏的慢性过程中,肝脏上的3大类抗生素10种ARGs在时空上的特征,初步表明了动物有机体中肝脏指数和微生物群落对ARGs的影响,引起了ARGs传递给肝脏中的细菌及对微生物群落结构改变起到促进作用,为今后控制ARGs的传播在一定程度上提供更多可能的数据支撑。
【图文】：

转移途径,细菌

株菌间进行转移，使接受菌获得抗生素抗性的过程[47]。Luo 等已经证RGs 存在于质粒上，携带 ARGs 的质粒经接合作用可进行转移，在间及不同种属细菌间进行相互传递，甚至有些转移也可发生在细菌。Rhodes 等的研究有发现，四环素抗性基因能够被质粒等移动元件播，如可在微生物群落中的产气单胞菌和大肠杆菌间相互转移[49]。P 等基于其试验研究表明，在自然界中的微生物，其 DNA 会因微生亡，进一步细胞壁出现破裂而被释放，直接进入环境中并在一定自然存留[50][51]。因此，ARGs 也可以在不依赖环境中微生物宿主的转移释放出来，，污染环境并造成危害。整合子若位于染色体上，可由垂直着，其本身在不借助移动元件的条件下不能进行移动的，正是借着这传给子代细菌[52]。

原理图,原理图,生物体,预序

那么样本中大量的基因就能同时被快速检测出来图 1-2。在生物体中，基因被转录并拼接（在真核生物A 转录本（图中红色标记）。mRNA 从生物体中提取、稳定的 ds-cDNA 中（图中蓝色标记）。在微阵列中，ds记（图中橙色标记）。这些被标记的片段与一组有序的起，并测量阵列中的荧光强度，荧光强度代表了一组预序列通常被选为目标基因组的报道序列。
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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