乳酸杆菌上清对LPS致敏小鼠肠道免疫调节效应和肝脏保护作用

发布时间：2020-05-14 21:52

【摘要】：乳酸杆菌为应用最早、研究最多的益生菌种之一,广泛应用于畜禽养殖。但是,目前研究集中于菌种筛选和应用效果评价,而乳酸杆菌特别是其成分和培养上清对动物肠道的实际免疫调节效应未引起足够关注。本研究旨在解析鼠李糖乳酸杆菌(LGG)和罗伊氏乳酸杆菌(ZJ617)组成成分与代谢产物(培养上清)对脂多糖(LPS)致敏小鼠肠道免疫和屏障功能、肝脏炎症的缓解调节作用,解析乳酸杆菌益生调节机制。1)体外细胞试验研究:构建LPS致敏的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型,分析LGG不同成分(SLP、CpG和DNA)和及其代谢产物预处理对细胞的免疫调控作用。结果显示:与对照组组比较,SLP与CpG或DNA组合可显著抑制LPS诱导的ERK1/2的磷酸化,优于SLP、CpG和DAN单独使用的效果。乳酸杆菌无细胞上清液(LGGs和ZJ617s)预处理细胞,显著抑制LPS诱导的LC3表达、ERK1/2和mTOR的磷酸化升高,同时提高抑制信号分子I-κBα表达,发挥抑制缓解炎症作用。2)动物试验研究(肠道):以连续灌胃乳酸杆菌无细胞上清液LGGs和ZJ617s两周后(剂量为0.2ml/天,剂量相当于用10~9的LGG和ZJ617菌体处理),腹腔注射LPS,致敏24小时后,屠宰采集血清、肝脏和肠道样品。采用免疫印迹Western blot、免疫荧光、ELISA、代谢组学方法,分析乳酸杆菌培养上清液对回肠的免疫调节效应和对肝脏的保护作用。1)肠道组织结果显示:LPS刺激后,小鼠回肠通透性增加,绒毛高度降低,TLR4、LC3、Atg5、Caspase-3和SOD2表达量均显著上调;LGGs和ZJ617s干预后,肠道屏障功能恢复到正常水平,蛋白的表达与对照组无显著差异。2)回肠内容物代谢组学分析显示,Con组与LPS组之间总共有35个差异代谢物(33个上调,2个下调);LPS组与LPS+ZJ617s组相比,共有16个差异代谢物,均显著降低;三组之间比较共有10个差异代谢物。3)动物试验研究(肝脏):肠道屏障功能和稳恒,进一步会影响肝脏功能,存在肝肠轴,为此,动物试验同上,进一步分析乳酸杆菌上清液LGGs和ZJ617s对LPS刺激小鼠肝脏功能的影响。小鼠肝组组织病理切片显示,ZJ617s和LGGs组明显改善LPS致敏小鼠肝炎中的肝小叶结构。LPS刺激后小鼠血清D-木糖和二胺氧化酶(DAO)水平显著升高,而ZJ617s和LGGs处理恢复其值正常水平。LPS刺激导致Claudin3、Occludin和ZO1蛋白表达下调,ZJ617s预处理后回归正常水平。炎症信号通路分析显示,LPS刺激导致肝脏TLR4显著增加,ZJ617s和LGGs处理使其蛋白表达回归正常水平;LPS刺激显著提高了p38、ERK和JNK的磷酸化水平,而ZJ617s和LGGs预处理组磷酸化水平恢复至正常水平。自噬信号通路分析显示,LPS刺激引起肝脏自噬信号通路的关键蛋白Atg5和LC3显著升高,引发过度自噬,而ZJ617s和LGGs预处理显著降低LPS的刺激诱发的过渡自噬。凋亡信号通路分析显示,LPS刺激显著增加小鼠肝脏凋亡通路上的SOD2和Caspase3蛋白的表达量,ZJ617s和LGGs的处理使其蛋白表达回归到正常水平。因此,乳酸杆菌LGG的有效成分SLP+CpG和SLP+DNA能显著缓解LPS诱导的炎症反应。LGGs和ZJ617s干预,使LPS刺激小鼠肠道屏障功能恢复到正常水平。乳酸杆菌上清液通过抑制TLR4-MAPK-NF-κB炎症信号通路、自噬和凋亡信号通过,缓解LPS诱导肝脏损伤。
【图文】：

图2.1不同时间点的LPS对RAW264.7细胞蛋白表达水平的影响Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 对 LPS 致敏的 RAW264.7 细胞的免疫调节作用构建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬细胞系模型，选取 MOI=10 的 LGG 预处理细胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬细胞 0.5 h，检测 I-κB 表达量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。结果显示，LPS 组的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明显升高，I-κB 蛋白表达量显著降低。LGG预处理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平显著下降，I-κB 蛋白表达量显著升高。

图2.1不同时间点的LPS对RAW264.7细胞蛋白表达水平的影响Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 对 LPS 致敏的 RAW264.7 细胞的免疫调节作用构建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬细胞系模型，，选取 MOI=10 的 LGG 预处理细胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬细胞 0.5 h，检测 I-κB 表达量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。结果显示，LPS 组的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明显升高，I-κB 蛋白表达量显著降低。LGG预处理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平显著下降，I-κB 蛋白表达量显著升高。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2

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本文编号：2663990