马立克病病毒miR-M4-5p宿主靶基因cDNA文库的构建及鉴定

发布时间：2020-05-16 03:05

【摘要】：马立克病病毒(MDV)是少数感染自然宿主后可诱发淋巴瘤的疱疹病毒之一,是研究肿瘤发生及发展的理想动物模型。目前已报道MDV可编码数十种miRNA,其中MDV-1编码的miR-M4-5p被鉴定为宿主细胞miR-155的同源物,由于miR-155与人类多种肿瘤性疾病密切相关,这意味着miR-M4-5p可能在MDV的致瘤过程中扮演重要角色。本研究旨在构建miR-M4-5p的宿主靶基因文库并进行初步鉴定。提取鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA,反转录合成cDNA,用hybrid-PCR扩增候选靶基因片段连接到pMD19-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞后挑选单克隆进行PCR鉴定及测序,通过BLAST比对分析,共获得88个宿主候选靶基因序列。优先选择miRNA结合靶点位于mRNA 3′-UTR且与miR-M4-5p种子序列(2~7nt)完全互补配对的29个候选靶基因,构建报告基因载体进行双荧光素酶报告试验,通过三轮双荧光素酶报告试验最终初步鉴定5个宿主靶基因:PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1,为进一步揭示miR-M4-5p的分子调控机制奠定了重要基础。
【图文】：

ＬＬＡＲＩＩ，，轻柔混合均匀后用Ω酶标仪（ＯＭＧＬａｂｔｅｃｈ）测定萤火虫荧光素酶数值。最后向每孔加入１００μＬＳｔｏｐａｎｄＧｌｏＲｅａｇｅｎｔ，轻柔混合均匀后，同上测定海肾荧光素酶数值。最后统计分析海肾荧光素酶／萤火虫荧光素酶活性比值。２结果２．１ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ宿主候选靶基因ｃＤＮＡ文库的构建将ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ产物电泳分析后割胶回收（图１），连接ｐＭＤ１９－Ｔ载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９后铺板培Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ图１Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ特异性引物示意图（Ａ）和ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ产物电泳分析（Ｂ）Ｆｉｇ．１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐｈｙｂｒｉｄｐｒｉｍｅｒ（Ａ）ａｎｄａｇａｒ－ｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂ）３５２

２）。其中，结合位点在３′－ＵＴＲ的基因有６３个，结合位点在ＣＤＳ的基因有２０个，结合位点在５′－ＵＴＲ的基因有５个。结合位点在３′－ＵＴＲ的６３个基因中有２９个基因的结合位点与ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ的种子区完全互补（包括Ｇ：Ｕ）。我们优先选择这２９个基因进行下一步的ＤＬＲＡ试验分析。Ｍ．ＤＮＡ相对分子质量标准；１～１２．菌液克隆号Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－１２．Ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌｕｉｄ图２Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ产物的部分菌液ＰＣＲ产物电泳分析Ｆｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ表２ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ靶标文库候选基因列表Ｔａｂｌｅ２ＰｕｔａｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｍＲＮＡｓｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ编号Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ结合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ编号Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ结合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ编号Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ结合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ１ＣＳＮＫ２Ａ２３′－ＵＴＲ３１ＲＡＣ１３′－ＵＴＲ６１ＰＰＭ１Ｅ３′－ＵＴＲ２ＰＤＫ３３′－ＵＴＲ３２ＲＢＭ２４３′－ＵＴＲ６２ＰＣＹＴ１Ａ３′－ＵＴＲ３ＰＲＩＣＫＬＥ１３′－ＵＴＲ３３ＦＫＢＰ７３′－ＵＴＲ６３ＳＬＣ１２Ａ４３′－ＵＴＲ４ＳＥＰＴ２３′－ＵＴＲ３４ＭＡＲＣＫＳ３′－ＵＴＲ６４ＲＰＬ２７ＣＤＳ５ＰＰＦＩＢＰ１３′－ＵＴＲ３５ＮＤＦＩＰ１３′－ＵＴＲ６５ＲＰＬ１２ＣＤＳ６ＣＯＬＡ３′－ＵＴＲ３６ＳＴ５３′－ＵＴＲ６６ＣＣＴ２Ｃ

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