2015-2017年禽腺病毒的分离鉴定及分别表达禽腺病毒penton和fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建

发布时间：2020-05-16 03:23

【摘要】：心包积液综合征(HPS)是由禽腺病毒引起的高度传染性疾病,于1987年首次在巴基斯坦的安加拉地区爆发,因此又被称作“安加拉病”。禽腺病毒为无囊膜病毒,基因组为双链DNA,病毒的核衣壳由六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤丝蛋白(fiber)组成。penton蛋白是重要的结构蛋白,参与病毒侵入细胞和病毒粒子组装的过程。抗penton蛋白的抗体具有显著的病毒中和作用,由penton蛋白制备的亚单位疫苗能为动物提供90%的保护率。病毒fiber蛋白通过其N末端与penton蛋白结合,其头端在病毒感染过程中可以与细胞表面的受体结合,在病毒感染过程中起到了关键作用,通过真核和原核表达系统制备的fiber2亚单位疫苗对SPF鸡具有较强的免疫保护力。近年来禽腺病毒在我国鸡群的感染普遍,给养殖业造成了严重的经济损失,目前尚无商品化的疫苗。为了研制用于该病预防的活疫苗,本研究在病原流行病学研究基础上,以新城疫病毒(NDV)为载体表达了该病毒的五邻体和纤丝蛋白,并对重组病毒的免疫效力进行了测定,旨在为该病的防控提供有力工具。1.I群禽腺病毒的分离鉴定与遗传进化分析通过对培养基和培养条件的优化,建立了 LMH细胞培养禽腺病毒的方法,经LMH细胞扩增的禽腺病毒滴度可达到108.5TCID50/ml,而通过传统绒毛尿囊膜扩增的禽腺病毒滴度为106.5TCID50/ml,表明通过LMH细胞培养可以收获更高滴度的禽腺病毒,培养滴度较传统方法提高了 100倍。2015-2017年共收到送检疑似禽腺病毒感染样品27份,通过PCR鉴定后,分离得到了 18株Ⅰ群禽腺病毒,其中有16株属于血清4型,有2株属于血清1型,表明在我国心包积液综合征主要由血清4型禽腺病毒感染所引发。分别对16株血清4型禽腺病毒病毒的hexon、penton和fiber2基因序列进行同源性分析,发现16株病毒的这三个基因与国内参考株之间的同源性均为100%,与国外分离株相比具有不同程度的遗传差异,其中与印度分离株最近。氨基酸序列比对分析发现国内hexon的195位氨基酸残基是Q,而国外毒株的对应位点是E;国内分离毒株penton的426位和486位分别是V和T,而国外毒株对应位点分别是I和S,表明我国流行的禽腺病毒具有特征性的遗传标记,通过这些特征性的氨基酸序列可以将国内外的禽腺病毒分离毒株进行有效区分。此外,挑选了不同年份的血清4型禽腺病毒3株,经肌肉接种SPF鸡后,可导致100%发病,剖检可见明显的心包积液病变,表明该疾病复制成功。2.分别表达禽腺病毒penton和fiber2蛋白的重组新城疫病毒构建及其免疫效力选取具有良好复制能力和免疫原性的基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)致弱毒株AI4作为骨架,分别将血清4型分离株JSYC2017株的penton和fiber2基因插入到AI4的P和M基因之间,构建得到重组NDV全长质粒:pNDV/rAI4-penton和pNDV/rAI4-fiber2。将全长质粒和NDV三个辅助质粒共转染BSR细胞后成功拯救出重组NDV病毒,分别命名为:rAI4-penton 和 rAI4-fiber2。重组病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)大于120h,呈典型的弱毒特性,且在鸡胚中具有良好的复制能力,rAI4-penton和rAI4-fiber2在鸡胚尿囊液的HA效价分别为9log2和7log2,EID50分别为1.5×108/ml和3.2×107/ml,病毒生长曲线测定结果表明重组病毒与载体病毒具有相似的生长动力学特性。重组病毒在鸡胚中连续传5代后仍能表达外源蛋白,显示出了较好的遗传稳定性。将重组病毒rAI4-penton和rAI4-fiber2以106EID50/只的剂量滴鼻点眼免疫SPF鸡,免疫后3周,重组病毒rAI4-penton免疫组可以检测到针对禽腺病毒的中和抗体,中和效价为1:64,攻毒后重组病毒rAI4-penton对免疫鸡能提供有效的保护效力。上述研究为禽腺病毒重组活载体疫苗的研制提供了有益参考。
【图文】：

３结果逡逑３．１邋ＬＭＨ细胞的培养与病毒传代逡逑在本实验室利用ＬＭＨ细胞成功培养了血清４型禽腺病毒，由图１－１可知，未接种病逡逑毒前，ＬＭＨ细胞呈现多形性，有树突样结构，接种后，细胞易感、发生明显病变，出现皱逡逑缩变圆。按照２．７中的方法对扩增的禽腺病毒的ＴＣｒｏ５0进行滴定，滴度达到１０８邋５ＴＣＩＤ５0／ｍｌ，逡逑表明禽腺病毒在ＬＭＨ细胞中成功扩增并达到较高滴度，将扩增的病毒置于－７０°Ｃ保存以备逡逑后用。逡逑

３．７动物回归实验逡逑在不同年份的分离株中挑选３株，分别用绒毛尿囊膜接种和ＬＭＨ接种进行培养，通逡逑过测量病毒的ＴＣＩＤ５0，，三株病毒在尿囊膜或ＬＭＨ细胞上扩增的滴度相当（图１－４），采用逡逑尿囊膜扩增的病毒滴度达到１０＆５ＴＣＩＤ５（）／ｍｌ，而通过ＬＭＨ细胞扩增后，滴度达到逡逑１０８邋５ＴＣＩＤ５Ｑ／ｍｌ，病毒滴度是传统的鸡胚扩增方法的１００倍。逡逑３邋ｉ0ｉ邋Ｉ邋＊＊邋Ｉ邋？邋＊＊邋｜邋Ｉ邋＊＊邋Ｉ逡逑ｇ逦１逦＇逦１逦１逦１逦１邋Ｍ邋Ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ邋ｃｈｉｃｈｅｎ邋ｅｇｇｓ逡逑８．邋品逦；ｉＴｉ逦＿邋ｌｍｈ逡逑§逦磁逦ｆｉｆ逦ｆ》：逡逑！；１Ｍ逡逑＜／逦＾邋Ｚ逡逑／邋／邋／逡逑图１４分离株在鸡胚和ＬＭＨ细胞上的繁殖滴度逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ＦＡＶ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＥＣＥ邋ａｎｄ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ逡逑将扩增的病毒接种ＳＰＦ鸡后，３ｄ起开始发病，表现被毛杂乱，精神萎靡，食欲减退，逡逑可见卧地不起和死亡，发病率为１００％，剖检可见肝脏黄染质脆，心包内有透亮的积液（见逡逑？Ｉ！邋＾逡逑图１－５血清４型禽腺病毒分离株对鸡的感染性实验逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈｉｃｋｅｎｓ邋ｗｉｔｈ邋ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ＦＡＶ４邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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本文编号：2666092