贾第虫病毒RNA依赖RNA聚合酶互作蛋白的筛选与鉴定

发布时间：2020-05-17 10:01

【摘要】：十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis),曾被称为蓝氏贾第虫(Giardia lamblia),简称贾第虫(Giardia),作为一种寄生性原虫,主要造成人和动物腹泻等临床症状,在世界范围内分布流行,严重威胁着动物和人类健康,但目前仍缺乏有效的药物或疫苗进行防控,究其原因主要是对贾第虫的致病机制不完全清楚。贾第虫作为一种“模式生物”,因此对贾第虫相关机制的研究显得尤为重要。寄生虫病毒专性寄生于虫体内,研究显示,原虫病毒能够影响原虫本身的致病性和毒力。相关报道表明贾第虫病毒感染后能抑制贾第虫的生长,降低贾第虫的致病性,从而减轻贾第虫病的临床症状,虽然贾第虫病毒的侵入可以改变贾第虫的生长发育特征,但贾第虫和贾第虫病毒之间的作用机制还需要进一步的深入研究。RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作为dsRNA病毒编码的主要蛋白,研究表明RdRp蛋白在发挥其重要作用时,可与病毒其他成分或者宿主因子发生相互作用,但是关于十二指肠贾第虫病毒RdRp蛋白的相关研究还相对较少。因此,本研究通过构建贾第虫酵母双杂交cDNA文库,筛选RdRp蛋白的相互作用蛋白,并利用GST pull-down、免疫共沉淀、双分子荧光互补和Duolink?PLA技术分别验证RdRp蛋白与互作蛋白间的相互作用。贾第虫酵母双杂交cDNA文库的构建:通过Trizol法提取贾第虫滋养体(WBc2株)RNA,反转录为cDNA,利用SMART技术构建贾第虫酵母双杂交c DNA质粒文库,结果表明构建的文库库容为3.7×10~6 cfu,随机挑取的60个单克隆菌落中插入片段在400bp~2kbp范围内,文库的重组率约为100%。贾第虫病毒RdRp互作蛋白的筛选:利用基因工程技术,将PCR扩增得到的贾第虫病毒RdRp片段与诱饵载体pGBKT7重组构建诱饵质粒pGBKT7-RdRp,并将诱饵载体转化Y2HGold酵母感受态细胞。结果表明该诱饵蛋白在酵母细胞中成功表达,对酵母细胞无明显毒害作用,且无自激活现象。将pGBKT7-RdRp与cDNA文库质粒共转化感受态筛选互作蛋白,初步筛选出与RdRp相互作用的蛋白是伴侣蛋白J,α-半乳糖苷酶试验初步验证了RdRp与伴侣蛋白J存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J相互作用的体外验证:构建原核表达载体pET-32a-RdRp和pGEX-4T-1-伴侣蛋白J,诱导表达并纯化获得重组蛋白,结果显示二者均能可溶性表达蛋白,将表达纯化的重组蛋白RdRp与伴侣蛋白J共孵育,通过GST pull-down技术验证两种蛋白在体外存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J在细胞内相互作用的验证:构建真核表达载体pcDNA-His-RdRp和pcDNA-HA-伴侣蛋白J,共转染HEK-293T细胞,Western blot检测蛋白表达情况。结果显示RdRp与伴侣蛋白J均能在HEK-293T细胞中表达,免疫共沉淀结果表明两种蛋白存在相互作用。将构建的双分子荧光载体pbFos-RdRp和pbJun-伴侣蛋白J共转染到HEK-293T细胞,双分子荧光技术验证RdRp和伴侣蛋白J在HEK-293T细胞中存在相互作用。RdRp与伴侣蛋白J在十二指肠贾第虫内相互作用的验证:制备兔源RdRp蛋白和鼠源伴侣蛋白J蛋白多抗血清,利用Duolink?PLA技术验证RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫体内的相互作用,发现红色荧光主要分布在贾第虫的细胞质中,结果表明RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫内存在相互作用。伴侣蛋白J功能的初步研究:将浓度为100μM和200μM的抑制剂KNK437分别处理贾第虫滋养体,以降低伴侣蛋白J的基因表达,检测对贾第虫增殖和贾第虫病毒复制的影响。表明伴侣蛋白J表达量下降后可降低贾第虫滋养体的增殖以及贾第虫病毒的拷贝数,初步表明伴侣蛋白J对贾第虫病毒RdRp具有正调节作用。综上所述,通过构建贾第虫酵母双杂交cDNA质粒文库初步筛选出与RdRp存在相互作用的蛋白是伴侣蛋白J,利用GST pull-down、免疫共沉淀和双分子荧光互补技术验证了RdRp和伴侣蛋白J的相互作用,并利用Duolink?PLA技术进一步验证了RdRp和伴侣蛋白J在贾第虫的细胞质中存在相互作用,并初步研究发现其对贾第虫病毒呈正调控作用,这为深入研究贾第虫伴侣蛋白J对贾第虫病毒的作用提供了理论基础。
【图文】：

滋养体,贾第虫,鞭毛运动,培养基

贾第虫滋养体培养

贾第虫,滋养体,分光光度计,凝胶电泳

贾第虫TotalRNA
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72

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