河南省犊牛腹泻主要病原调查及犊牛腹泻微流控芯片验证

发布时间：2020-05-17 10:13

【摘要】：犊牛腹泻是导致新生犊牛死亡的主要病因之一,也是造成世界范围内养牛业经济损失的原因之一。引起犊牛腹泻的病因有很多,感染性因素被认为是引起腹泻的主要因素。大肠杆菌K99~+、轮状病毒A群、冠状病毒、隐孢子虫这四种病原被认为是引起犊牛腹泻的主要病原。近年来国内外学者运用多种方法对犊牛腹泻主要病原分离鉴定,同时积极探索犊牛腹泻快速诊断方法。本研究对河南省犊牛腹泻主要病原进行调查,同时对犊牛腹泻微流控基因芯片进行验证,为本省犊牛腹泻疾病的防控提供科学依据,为犊牛腹泻诊断提供新的技术方法。研究一:犊牛腹泻主要病原PCR鉴定方法的建立。为建立主要病原的PCR鉴定方法,以ELISA方法作为对照。在100份犊牛腹泻样品中,轮状病毒ELISA方法检出率为15%,轮状病毒A群PCR方法检出率为16%。冠状病毒ELISA方法检出率为5%,PCR方法检出率为7%、大肠杆菌K99~+ELISA方法检出率为2%,PCR方法检出率为3%。结果显示PCR方法检出率要高于ELISA方法,微小隐孢子虫ELISA方法和PCR方法检出率均为14%,但是PCR方法还鉴定出牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫。研究二:河南省犊牛腹泻主要病原调查。为调查河南省犊牛腹泻病原情况,使用研究一建立的PCR方法对147份腹泻犊牛和65份无临床症状犊牛粪便样品进行上述四种病原筛查。在147份腹泻样品中隐孢子虫阳性样品44份,检出率为29.93%。轮状病毒A群阳性样品18份,检出率为12.24%。冠状病毒阳性样品7份,检出率为4.76%。大肠杆菌K99~+阳性样品3份,检出率为2.04%。在65份无临床症状犊牛粪便样品中共检出隐孢子虫阳性样品12份,检出率为8.16%。轮状病毒A群阳性样品3份,检出率为2.04%。未检出冠状病毒和大肠杆菌K99~+。在147头腹泻犊牛59头犊牛为单一病原感染,12头犊牛为两种病原混合感染,1头犊牛为三种病原混合感染,病原检出有地区差异。研究三:犊牛腹泻微流控基因芯片相关指标验证。为了验证犊牛腹泻微流控基因芯片的准确性,使用微流控基因芯片对147份腹泻犊牛粪便样品进行病原筛查,对微流控基因芯片上的隐孢子虫和冠状病毒两个指标进行验证。共检出隐孢子虫阳性样本44份,冠状病毒5份。经过比对两种方法阳性样品检出有较高的一致性。PCR方法和微流控基因芯片方法在对两个病原检出率无显著差异(P0.05)。虽然在本试验中样品数量较少,但是通过本次试验的对这两个检测指标验证,表明微流控基因芯片技术在犊牛腹泻病原实验室诊断方面有着一定的应用价值。
【图文】：

图 2.6-1 隐孢子虫凝胶电泳图S2000 泳道（P）:阳性对照 泳道（N）:阴性对照 其余为泳道编Figure 2.6-1 Cryptosporidium gel electrophoresisM:DS2000 （P）:positive control （N）：negative controlR 阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结约为 830 bp，与目标片段一致。将测序所得到的核苷酸序列通bi.nlm.nih.gov）比对后，其中 14 个基因序列与 GeneBank 上的同源性，10 个基因序列与牛隐孢子虫有较高的同源性，4 个高的同源性。tar MegAlign 软件进行序列分析（见图 2.6-2），微小隐孢子虫性 97%以上，微小隐孢子虫各阳性株之间的同源性在 95%以同源性在 98%以上，，这 14 个基因片段是微小隐孢子虫片段。虫阳性株为：KF1、PY5、PY7、XC1、PDS1、XX2、PY9、11、PY11、PY12。虫参考株 GeneBank 的登录号：Cp-13（KT151548）、92（MF1

图 2.6-2 微小隐孢子虫核苷酸序列同源性分析Figure 2.6-2 Homology analysis of nucleotide sequences of Cryptosporidium parvum使用 DNAstar MegAlign 软件进行序列分析（见图 2.6-3），10 个牛隐孢子虫各阳性株与参考株之间的同源性 98%以上，牛隐孢子虫各阳性株之间的同源性在 97%以上，牛隐孢子虫阳性参考株同源性在 99%以上，这 10 个基因片段是微小隐孢子虫片段。牛隐孢子虫阳性株为：SMX1、SMX3、 SMX6、 SMX9、 SMX4、 SMX7、ZZ1、ZZ4、ZZ5、ZZ8。牛隐孢子虫参考株 GeneBank 的登录号：Chan-C90（KT922232）、151（HM002490）。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

【参考文献】

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本文编号：2668368