【摘要】：禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)可引起鸡的良性、恶性肿瘤和亚临床感染,导致鸡只生长迟缓、产蛋下降和免疫抑制。近年来,尤其是J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)在中国鸡群中广泛传播,对鸡群的安全构成了严重的威胁,给我国养殖业的发展带来了巨大的困扰。准种是RNA病毒在突变选择平衡下存在的一种特殊形式,是病毒多样性产生的重要原因。而ALV-J作为典型的反转录病毒,也存在着准种现象。本研究分别利用常规测序和高通量测序对我国ALV-J在地方品系鸡群及个体鸡只中的基因多样性进行了系统分析;探究了ALV-J在不同宿主内的演变规律;建立并探索了发生垂直传播的ALV-J准种变异规律的动物模型;建立了ALV-J体外药物选择压模型,并利用高通量测序技术对ALV-J在齐多夫定药物选择压下耐药机制进行了揭示;以上研究加深了我们对ALV-J在不同组织、细胞和药物选择作用下的基因多样性的理解。1.ALV-J在同一鸡群不同个体内病毒的基因多样性为深入了解在我国某地方品系鸡中ALV-J的流行情况及其基因多样性,我们从一个地方品系鸡群不同个体中,通过病毒分离和间接免疫荧光试验分离鉴定到10株ALV-J,分别命名为JS16JH01-JS16JH10。为进一步了解其病毒基因组的分子学特征,我们对其env-LTR基因进行常规测序,通过与参考毒株比对发现,gp85基因同源性在89.6%-92.0%之间,U3区同源性介于88.9%-92.5%,这些分离株相互间的gp85基因同源性在92.0%-98.0%之间;同时相比参考毒株,gp85蛋白的氨基酸存在多个突变和缺失位点,其中有2个毒株在gp85上出现了同样的RGQP插入突变(JS16JH01和JS16JH06),且这些毒株在进化树上形成了一个新的分支。以上研究说明该地方鸡群中仍然存在复杂的ALV-J的感染情况,且存在很大的基因多样性,这提示我们需要将更多的注意力放在地方品系鸡中ALV的净化。2.高通量测序与常规测序在ALV-J准种研究中的应用比较为了验证高通量测序在研究准种时的可应用性,我们系统比较了高通量测序和常规Sanger测序在准种研究中的优缺点。结果发现在2次重复试验中高通量测序在研究准种时的准确性和重复性都要显著优于Sanger测序。其次在不同位点的氨基酸比例也显示出高通量测序具有较好的稳定性,且更准确的显示了该位点的氨基酸构成;而Sanger测序由于挑选克隆样品的随机性和数量限制导致位点的比例不稳定。最后我们应用高通量测序数据模拟常规Sanger测序在研究抗体选择压下准种构成的可行性,发现抗体滴度越高,序列的香农熵值越大,至少需要800条序列才能准确反映准种的构成,而用Sanger测序的应用可能性越小。因此,高通量测序相比常规Sanger测序更适合于准种研究。3.高通量测序研究同一只鸡体不同脏器内ALV-J基因多样性为了更全面地研究同一只鸡体不同器官内ALV-J的基因多样性,分别利用常规Sanger测序和Mi Seq高通量测序对其不同脏器的病毒RNA gp85基因的2个高变区(gp85-A和gp85-B)和LTR-U3进行测序。筛选各器官内的前3名优势突变株,通过系谱进化树和同源性比较发现卵泡中的病毒分别在gp85-A、gp85-B和LTR-U3演变出与其他器官内的差异较大的优势突变株。在肝脏、脾脏和血浆中发现gp85-B段含有“LSD”3肽插入突变的优势突变株,但是在其他器官内没有发现这种突变。全局选择压力分析显示卵泡和卵巢相比其他器官受到更强的选择压力。结合常规测序,发现这3段区域的最优势突变株均可以在同一条病毒序列中发现,因此证明卵泡中这3段区域是共演变的。高通量测序让我们更加清楚地认识到,ALV-J的基因多样性不仅存在于群体水平,在同一个体的不同脏器内也具有很复杂的基因多样性,并且发现卵泡中的病毒相比其他器官差异最大。4.ALV-J在垂直传播过程中的演变规律前期的研究发现卵泡内的ALV-J与其他器官差异很大,那么其是否可以垂直传播到子代?子代体内的病毒与母体哪个脏器组织关系最密切呢?针对这个问题,本研究构建了ALV-J的垂直传播模型,获得了3只持续病毒血症阳性但抗体阴性且能产蛋的母鸡,收集它们的种蛋并孵化,分别获得了对应3只母鸡的3只病毒血症为阳性的雏鸡。取母鸡的血浆、肝脏、脾脏、肾脏、卵泡以及对应雏鸡的血浆,直接提取病毒RNA进行RT-PCR分别针对gp85的2个高变区和LTR-U3区利用Hi Seq 2500平台进行高通量测序。分别筛选各个脏器内的前3名优势突变株并分析。结果显示,gp85-B段在子代雏鸡和母鸡之间出现了规律性演变,即在系谱进化树分析时,子代雏鸡血浆中的病毒与卵泡内病毒第一名优势突变株出现在同一个新的分支中。同源性分析发现,子代雏鸡血浆中的病毒与母鸡体内卵泡内的病毒的同源性最高;氨基酸序列比对也发现子代雏鸡血浆中的病毒相比其他器官出现了与卵泡内病毒相同的氨基酸位点突变。SNP分析显示子代雏鸡与母体内病毒具有不同的突变位点。以上结果均证实了子代雏鸡血浆中的病毒更可能来源于母鸡卵泡内的病毒。ALV-J在垂直传播过程中的演变规律增加了其基因多样性并加速了病毒的演化,从而使ALV-J更易在不同的宿主环境中生存。5.高通量测序研究ALV-J在不同感染宿主系统内的演变动态作为一种典型的逆转录病毒,在不同易感宿主系统中ALV-J的演变规律很少被报道,我们所知道的是有大量不同的突变株,即具有相当大的基因多样性的准种。本研究利用高通量测序探讨了ALV-J肝脏研磨液分别接种DF-1细胞与SPF鸡后的演化动态学差异。在不同的易感宿主系统中,从每个样品的gp85基因的两个高变区和LTR-U3区域分别获得了平均约20,000条有效序列。分析发现,在两只鸡的血浆中,大部分突变株gp85-B含有的“LSD”3肽重复插入,而其在DF-1细胞培养上清液中的比例仅占不到0.01%。不同易感宿主系统中gp85-B序列的香农熵和全局选择压力值(ω)也存在显著差异。此外,来自鸡血浆、DF-1细胞和肝脏研磨液中的LTR-U3的前十名突变株有9株序列是不同的。相比DF-1细胞来自鸡体的LTR-U3区发现更多的可引起转录调控元件改变的突变位点。所有数据一起表明,基于病毒分离得到的ALV-J而形成的分子流行病学可能并不能代表病毒在鸡群中的真正演化情况。6.ALV-J在药物选择压下的变异及耐药性的产生机制齐多夫定(AZT)是一种具有抗反转录酶活性的抗HIV药物,而反转录病毒ALV也同样具有反转录酶基因。之前的研究发现在AZT选择作用下ALV-J产生了耐药性,为了研究ALV-J在药物选择压下的变异及其耐药性的产生机制,将ALV-J的感染性克隆r SD1005株在含有AZT的DF-1细胞培养体系中连续传代50代,耐药试验显示r SD1005第50代毒株产生了对AZT的耐药性,对产生耐药性毒株的pol基因开展高通量测序,经组间差异性显著检验比较发现了一个可能与产生耐药性相关的pol基因变异位点T196A(p0.05)。在感染性克隆r SD1005株基础上构建了pol基因突变的点突变株SD1005-T196A,耐药性试验结果显示SD1005-T196A直接产生了对AZT的耐药性,说明该位点突变与ALV耐药性的产生密切相关。本研究发现了ALV-J在药物压力下耐药性的产生并确定了决定其耐药性产生的pol基因关键核酸位点pol基因T196A,为在体内研究逆转录病毒耐药性产生的分子机制提供了一个可靠的病毒模型。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
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