核酸适配体筛选技术平台建立及应用研究

发布时间：2020-05-17 14:58

【摘要】：在当今高度流动、相互依存和联系密切的情形下,感染性疾病以非常快的速度传播,对全球公共卫生构成严重的威胁。除了研发抗感染新型药物,有效监控感染过程也是控制感染性疾病的关键。核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从寡核苷酸文库中筛选得到的一种单链寡核苷酸分子,它通过与靶分子特异性结合影响靶分子的生物活性和生物学功能。目前针对病原微生物的核酸适配体筛选和应用研究备受关注,它不仅应用于疾病的诊断,还在病原与宿主的相互作用研究中发挥了特定的作用。本研究建立了核酸适配体筛选和应用平台,以番鸭细小病毒(MDPV)全病毒和水貂阿留申病毒(AMDV)VP2蛋白为靶标,筛选出了高亲和力、特异性良好的核酸适配体,并分别建立了针对MDPV的Label-free金纳米检测方法和针对AMDV的双夹心ELONA检测方法。通过临床样品检测,所建立的方法的特异性、敏感性、重复性良好。核酸适配体的抑制AMDV增殖活性结果表明,ADVa012在工作浓度达到4μM时抑制率可达47%,半衰期为31.68 h,且不会对CRFK细胞的增殖产生影响,结合位点分析结果显示ADVa012与VP2蛋白结合的优势区域位于P4(aa397-aa474)区域。以上结果表明,本研究成功建立了针对不同靶标(全病毒和蛋白)的核酸适配体筛选技术平台,成功筛选了 MDPV和AMDV VP2蛋白的核酸适配体,建立了基于核酸适配体的高灵敏检测方法,也证明了筛选的ADVa012核酸适配体具有明显的抗病毒作用。
【图文】：

包括三步：（１）结合，靶标与寡核苷酸文库结合；（２）分离，分离与逡逑靶标结合的序列；（３）扩增，将富集的序列进行扩增。最后获得的扩逡逑增序列用于制备下一轮结合的次级库，依次往复，如图１．１所示。逡逑＊＊邋一一邋 一飞逡逑｜逦Ｃｌｏｎｅ邋ａｎｄ逦Ｎｕｃｌｅｉｃ邋ａｃｉｄ逦Ｔａｒｇｅｔ：逡逑ｓｅｑｕｅｎｃｅ逦ｌｉｂｒａｒｙ逦＾＾Ｓｍａｆｈｍｏｌｅｃｕｌｅｓ逡逑？逦■逦？逦＾逦ｓｓＤＮＡ逦Ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑｜逦Ｉ逦Ｉ逦＼ｇ逦ＲＮＡ逦Ｖ逦Ｃｅｌｌｓ逡逑ｉ？ｊ逦Ｗ逦ＭｏｄＨｉｅｄ邋ＮＡｓ逦备逡逑！＾ｌｔｏ？Ｉ邋＝邋ＩｓＥＬＥＸ｜Ｕ逡逑（ｄａＤＮＡ）邋ｇ－邋（＆－２０邋ｃｙｃｌｅｓ）邋§邋Ｕ逡逑：ｌｉＣ邋Ａ逡逑Ｉ邋Ｐｏｓ卜ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ逦丨逦Ｂｏｕｎｄ逦Ｕｎｂｏｕｎｄ逡逑｜邋ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ逦｜逦ａｐｌａｍｅｒｓ逦ａｐｔａｍｅｒｓ逡逑ｉ．邋逦邋逦邋逦邋逦邋Ｊ逡逑图１．１邋ＳＥＬＥＸ筛选流程示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｉｇａｎｄｓ邋ｂｙ邋ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋（ＳＥＬＥＸ）逡逑２逡逑

包括三步：（１）结合，靶标与寡核苷酸文库结合；（２）分离，分离与逡逑靶标结合的序列；（３）扩增，，将富集的序列进行扩增。最后获得的扩逡逑增序列用于制备下一轮结合的次级库，依次往复，如图１．１所示。逡逑＊＊邋一一邋 一飞逡逑｜逦Ｃｌｏｎｅ邋ａｎｄ逦Ｎｕｃｌｅｉｃ邋ａｃｉｄ逦Ｔａｒｇｅｔ：逡逑ｓｅｑｕｅｎｃｅ逦ｌｉｂｒａｒｙ逦＾＾Ｓｍａｆｈｍｏｌｅｃｕｌｅｓ逡逑？逦■逦？逦＾逦ｓｓＤＮＡ逦Ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑｜逦Ｉ逦Ｉ逦＼ｇ逦ＲＮＡ逦Ｖ逦Ｃｅｌｌｓ逡逑ｉ？ｊ逦Ｗ逦ＭｏｄＨｉｅｄ邋ＮＡｓ逦备逡逑！＾ｌｔｏ？Ｉ邋＝邋ＩｓＥＬＥＸ｜Ｕ逡逑（ｄａＤＮＡ）邋ｇ－邋（＆－２０邋ｃｙｃｌｅｓ）邋§邋Ｕ逡逑：ｌｉＣ邋Ａ逡逑Ｉ邋Ｐｏｓ卜ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ逦丨逦Ｂｏｕｎｄ逦Ｕｎｂｏｕｎｄ逡逑｜邋ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ逦｜逦ａｐｌａｍｅｒｓ逦ａｐｔａｍｅｒｓ逡逑ｉ．邋逦邋逦邋逦邋逦邋Ｊ逡逑图１．１邋ＳＥＬＥＸ筛选流程示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｉｇａｎｄｓ邋ｂｙ邋ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋（ＳＥＬＥＸ）逡逑２逡逑
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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本文编号：2668736