中外猪种胚胎不同发育时期骨骼肌转录组和全基因组甲基化分析

发布时间：2020-05-17 19:10

【摘要】：猪是肉类蛋白的主要来源,同时,也可作为研究人类健康问题的重要医学模型。骨骼肌是动物体内最丰富的组织,因此研究猪骨骼肌的生长发育对肉质生产科学和人类医学都具有重大意义。本研究以生长速度和肉质性状存在显著差异的约克夏猪和通城猪作为研究对象,采用RNA-seq技术,探索了妊娠期40,55,63,70和90天两猪种胚胎背最长肌差异表达基因不同的时序性表达规律,推测了两猪种间肌纤维发育差异的时间拐点,在此基础上探究中外猪种在妊娠时期胚胎骨骼肌发育的分子调控机理;使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测了妊娠期55天两猪种胚胎背最长肌的差异甲基化图谱,分析了两猪种差异DNA甲基化对肌纤维发育的调控;并对转录组测序数据和全基因组重亚硫酸盐测序数据进行了联合分析,分析了DNA甲基化对两猪种肌纤维发育过程中差异表达基因的调控作用,主要研究内容和结果如下:1.利用RNA-seq技术获得了通城猪和约克夏猪妊娠5个时期的胚胎背最长肌的转录组表达谱,并利用荧光定量PCR验证了测序结果的可靠性。在通城猪和约克夏猪分别筛选到1317个和691个差异表达基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分别对上述通城猪和约克夏猪的发育依赖的DEGs进行时序性分析,发现了在两个猪种中都显著富集到的表达模式0,39,20和21,表达模式10,11,13和25只在通城猪中显著富集,表达模式14和15只在约克夏猪中显著富集。分别对通城猪和约克夏猪的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,结果发现两猪种共同表达模式39显著富集的GO条目中均发现了多个与肌肉生长发育相关的GO条目;共同表达模式0显著富集的GO条目中均发现了多个与细胞周期相关的GO条目。通路富集分析结果显示,通城猪和约克夏猪差异表达基因富集的前10条通路中有8条是两猪种共同富集到的,但富集程度不同。这些结果说明妊娠时期胚胎的背最长肌的发育机制在两猪种中有相似之处,又存在一定的差异。2.对两个猪种分别在5个时期的基因表达进行差异比较分析,总共获得了1677个差异表达基因。5个比较组中,妊娠55天的差异表达基因最多。对两个猪种间的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,发现黏着斑(Focal adhesion),细胞外基质受体互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8条显著富集的通路。然后,对两猪种间差异表达基因进行蛋白互作网络分析,发现PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖体蛋白基因可能对揭示两猪种胚胎肌肉发育差异有重要作用。3.通过ASprofile软件分析,发现第一个外显子可变剪切(TSS)和最后一个外显子可变剪切(TTS)事件是两猪种中最主要的可变剪切类型。4.本研究通过WGBS技术构建了通城猪和约克夏猪在妊娠55天时胚胎背最长肌全基因组DNA甲基化图谱,并揭示了其DNA甲基化特征:CG双核苷酸甲基化是两猪种基因组DNA甲基化的主要方式,只有极少部分DNA甲基化发生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位点甲基化水平在内含子和3?UTR中的DNA甲基化水平较高,而非CG位点甲基化水平在CGI区域最高。5.通过WGBS技术,通城猪和约克夏猪之间获得了211822个差异甲基化区域(DMR),涉及到了12261个差异甲基化基因(DMG),其中在通城猪中差异高甲基化的有36582个DMR,涉及到DMG个数为5301;在约克夏猪中差异高甲基化的DMR为175240个,涉及到DMG为11746个。对两猪种的DMGs进行GO和KEGG通路功能注释和富集分析,发现在CG、CHG、GHH三种不同序列环境下的DMGs都显著富集到多个GO条目;KEGG通路富集分析发现非CG序列环境下的DMGs均显著富集到多条通路,而CG序列环境下的DMGs只显著富集到磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositol signaling system)。通过WGBS技术,鉴定到启动子区域的DMR为5946个,涉及到DMG为4578个。对启动子区DMGs进行GO和KEGG通路富集分析,发现只有CHH序列背景下的DMGs显著富集到了GO条目,但是在三种序列背景下的DMGs主要富集到的GO条目中有一些与肌肉发育相关GO条目;在三种序列背景下的DMGs都没有显著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖体(Ribosome),这表明核糖体通路中基因启动子甲基化可能会调控肌肉的发育。6.对转录组测序数据与全基因组甲基化测序数据进行联合分析,通过在整体水平上分析DNA甲基化水平与基因表达水平的相关性,发现两猪种在基因转录起始位点上游2kb及基因本体靠近转录起始位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈负相关;基因本体靠近转录终止位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈正相关。检测到同时是DMG又是DEG的基因个数616个,对其进行通路富集分析发现,主要富集的通路中黏着斑,Wnt信号通路(Wnt signaling pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),细胞外基质受体相互作用和TGF-beta信号通路(TGF-beta signaling pathway)在肌肉生长发育中发挥着重要作用。7.构建候选基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并筛选到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫荧光技术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,肌管形态的变化,发现两个干涉组的肌管数目都明显低于对照组,且RPL6干涉组的肌管明显变粗。使用流式细胞术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,对C2C12细胞周期进程的影响,发现RPL6基因参与了细胞周期的调节,干涉RPL6后会使滞留于G1期的细胞比例显著高于对照组,滞留于S期和G2期的细胞比例显著低于对照组;发现干涉TPPP3后,细胞周期各阶段的细胞比例与对照组相比皆无明显差异。通过免疫荧光技术鉴定到超表达基因RPL6可以增加细胞中增殖细胞核抗原(PCNA:增殖标志基因)蛋白的表达
【图文】：

2-1 使用安捷伦 2100 生物分析仪检测猪背最长肌 RNA 质uantitation of one RNA sample by Agilent Technologies 210表 2-1 使用安捷伦 2100 生物分析仪检测 RNA 质量参数 quality of RNA samples detected by Agilent Technologies 2原液浓度(ng/μL)Conc (ng/μL）总量(ug)Total amount (ug)RIN 570.0 28.5 8.4 1680.0 67.2 8.2 760.0 22.8 8.1 1550.0 38.75 7.9 1090.0 43.6 8.6 1230.0 36.9 8.0 710.0 24.85 8.3 1780.0 53.4 8.4 1130.0 33.9 8.4 288.0 10.08 8.4 2580.0 116.1 8.5 1056.0 36.96 7.6 1080.0 32.4 7.4 2130.0 106.5 7.2

q 测序质量评估与质控格的30个RNA样品进行混样（同猪种同时期的三个样品文库，然后高通量测序，测序得到的原始图像数据文件经列（raw reads），结果以 FASTQ 文件格式存储，其中包质量信息。为了保证数据质量，需要在信息分析前对原据过滤等预处理。量分布检测序文库的碱基含量分布检测结果发现（图 2-2）（以 TC4 90-100bp 位置的核苷酸组成存在一定的偏好性，这主要 反转录成 cDNA 时所用的随机引物导致，而其他位置的、CG 分离现象，且各文库总体碱基比例分布均匀。该结了测序结果的准确性。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828

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本文编号：2669036