NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究

发布时间：2020-05-18 15:49

【摘要】：(1)利用TALENs/CRISPR技术制备NLRP3基因修饰猪背景:转基因抗病猪、高品质猪等拥有巨大的经济前景和社会效益。因为猪的胚胎干细胞系尚未建立,所以常用的方法是将体细胞基因修饰与体细胞核移植技术相结合产生克隆猪。但是由于体细胞的扩增代数有限,且体细胞打靶效率较低,定点基因修饰猪的推广受到限制。ZFN、TALENs和CRISPR技术的相继诞生使得基因定点敲除变得更为高效。人类NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)基因第260位氨基酸发生错意突变(R260W)会导致NLRP3炎症小体的激活而产生自身炎症性疾病。小鼠、猪在人类NLRP3 R260W基因致病突变位点的是保守的,小鼠对应氨基酸突变位点为R258W,猪对应氨基酸突变位点为R259W。在小鼠R258W突变的模型中,NLRP3炎症小体的活化并未表现出严重的炎症反应,而是导致其抗病力增强。提示我们通过在猪上模拟NLRP3基因的相同突变可能制备出抗病能力增强的克隆猪。此外,我们拟同时制备NLRP3基因敲除猪模型,通过对比NLRP3基因敲除猪和定点突变猪的各项生理指标差异,共同作为NLRP3炎性体相关疾病机理的大型动物模型。方法:我们分别利用TALENs、CRISPR基因修饰技术,在猪成纤维细胞上分别筛选出基因编辑活性较高的TALENs组合以及gRNA位点,然后分别将TALENs、CRISPR基因修饰技术与同源重组技术相结合,用于制备NLRP3基因修饰的猪成纤维细胞系。然后再结合体细胞核移植技术(SCNT),将重组胚胎体外培养后移植到受体母猪中,用于制备NLRP3敲除/定点修饰的转基因猪。结果:我们构建出针对猪NLRP3基因的TALENs打靶载体,以及用作同源重组模板的单链DNA(ssDNA),并筛选出活性最高的TALENs组合;同时构建了针对猪NLRP3基因的CRISPR基因编辑系统打靶载体,以及相应的ssDNA。我们利用CRISPR/Cas9基因修饰技术,获得了 10株NLRP3敲除的猪成纤维细胞系。我们利用CRISPR/Cpf1基因修饰技术结合同源重组技术,获得了 3株NLRP3定点突变的猪成纤维细胞系。我们将获得的NLRP3敲除/定点突变的猪成纤维细胞作为供体细胞,通过体细胞核移植技术和胚胎移植技术,成功获得了 28头NLRP3R259W纯合突变的克隆猪,1头NLRP3基因双拷贝敲除13bp的克隆猪。结论:我们模拟人自然发生的NLRP3基因突变,结合TALENs/CRISPR基因定点敲除技术、同源重组技术以及体细胞核移植技术,成功制备了 NLRP3基因修饰的克隆猪,以供进一步的研究。(2)RYR2突变的iPSCs建立和初步分化背景:诱导多能干细胞的出现为疾病模型的建立提供了新的思路。由于可以从患者自身的很多易得的细胞来源(例如尿液、皮肤成纤维细胞)诱导,且具有与胚胎干细胞相似的多能性,因此hiPSCs可用于建立个性化疾病模型,且不存在伦理问题,大大拓展了精准医学的范围。儿茶酚胺多形性室性心动过速Ⅰ型(CPVT1)是一种由兰尼碱受体2型基因(RYR2)单基因突变导致的遗传性心脏病。RYR2基因突变导致了心脏功能的紊乱,以应激诱发的室性心律失常为特征,每年会导致大量年轻人猝死。因此,建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病iPSCs并将其分化成心肌细胞,对于研究疾病机理,进行药物筛选等方面具有重要意义。方法:本研究利用慢病毒系统将Yamanaka四因子(Oct4、Sox2、Klf4和Nanog)整合到儿茶酚胺多形性室性心动过速I型(CPVT1)患者的皮肤成纤维细胞中,将其诱导成为iPSCs,并通过形态,表面抗原,基因表达,多能细胞特异性基因的表观遗传状态等方面验证其多能性。然后,再将iPSCs在体外定向分化成心肌细胞,并鉴定心肌细胞的特异性标志物的表达情况,从而初步建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病模型。结果:我们鉴定了一名儿茶酚胺多形性室性心动过速I型(CPVT1)患者的基因型特征,从该患者皮肤成纤维细胞诱导出了 2株hiPSCs。通过对获得的hiPSCs干细胞标记物染色,可见其表现出很强的碱性磷酸酶活性,且表达Oct4和Nanog以及胚胎干细胞细胞特异性表面抗原,包括阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA3),阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA4),肿瘤相关抗原TRA-1-60,TRA-1-81。通过对hiPSCs的Oct4基因启动子区域进行了去甲基化程度分析,确认2株hiPSCs,即iPS-2和iPS-4的Oct4基因启动子区域均被很大程度地去甲基化。通过实时荧光定量PCR的方法,发现hiPSCs中多能性基因的表达量显著高于成纤维细胞(P0.01)。通过采用RT-PCR方法,发现hiPSCs分化得到的拟胚体(EB)的三个胚层标志基因的表达量是hiPSCs的5～50倍,证明hiPSCs具有在体外分化成三个胚层的潜能。通过将hiPSCs接种非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠获得的畸胎瘤切片进行HE染色,证明hiPSCs具有在体内分化成三个胚层的潜力。我们还通过联重复技术(STR)检测确定了 iPS细胞为单一细胞来源,不存在交叉污染现象。以上证明我们诱导得到的hiPSCs具有很高的多能性。然后我们对RYR2 iPSCs进行了定向诱导分化,分化11天后可以观察到细胞有自发的跳动簇。我们采用RT-PCR检测发现跳动的细胞中心肌发育相关的早期基因的表达量为hiPSCs的20～40倍。结论:我们成功诱导了儿茶酚胺多形性室性心动过速I型(CPVT1)患者特异性iPS细胞系2株,并证明其具有很强的多能性。我们初步将iPS细胞向心肌细胞定向分化,可以观察到心肌细胞有节律收缩现象,并高表达心肌特异性标志物。但由于本研究处于初步探索阶段,心肌分化方案尚需完善,功能性验证实验尚未涉及,有待进行进一步研究。
【图文】：

序列,基因打靶,核酸酶,生殖细胞

这种精子介导的ＤＮＡ转移（ＳＭＧＴ）联合胞质内精子注射（ＩＣＳＩ）的效率逡逑相对较高，并且允许插入大的ＤＮＡ片段。逡逑这种方法依赖于被遗传修饰的生殖细胞移植干细胞（ＧＳＣｓ）的能力体外定殖逡逑受体睾丸并在移植后产生供体来源的精子。ＧＳＣ介导的生殖细胞修饰避免了与胚逡逑胎相关的问题操纵和细胞核重新编程。但因为生殖细胞移植干细胞（ＧＳＣｓ）难以逡逑在体外培养，，所以有针对性的突变使用ＧＳＣｓ的动物仍然是一个挑战Ｉ４＇逡逑１．３．２基因修饰方式逡逑基因编辑工程酶可以在特定基因的目标位点引入一个双链断裂（ＤＳＢ），使基逡逑因发生插入或缺失。一方面可以通过非同源末端连接（ＮＨＥｊ）修复引入突变，另逡逑－方面也可以通过同源性定向修复（ＨＤＲ）外源同源ＤＮＡ片段来实现靶向序列替逡逑换。逡逑

序列,物种,设计鉴定,测序

图２猪原代胚胎成纤维细胞逡逑纤维细胞的ＮＬＲＰ３基因序列逡逑ＢＩ查找的ＮＬＲＰ３序列（Ｇｅｎｅ邋ＩＤ：邋１００５１４８２３），分别将鼠的ＮＬＲＰ３基因进行对比。确认以上三个物种在目。逡逑ｐｒｏｃｅｍ．邋ｐｒｏ邋W涵曍帊shｇｇｓＥ？ｇＹＣ￡？谨团涵邋ｇ逡逑３ｐｒｃ＾ｅｉｎ．ｐｒｏｐｒｏｔ：ｅｉｎ．邋ｐｒｏ逦ｉＢＨ雨ｉｗＪｇＫ邋［ｄＳＢＳＢｒＨＳ邋５逡逑Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ邋ｊｅｐｖｈｃｖｖｆｑｇａａｇｉｇｋ＾ｉｉａｒＪｃ邋ｒｒｌｄｗａ邋１邋ｆｄｙｌｆ邋ｉｈｃｒ－人类、小鼠和猪的ＮＬＲＰ３基因的目的位点的保守性分显示第２５９位精氨酸（Ｒ）所在区域在三个物种中是上下游设计鉴定引物，以拟用于打靶的本实验室制备为模板进行扩增并测序，将测序结果与ＮＣＢＩ上提供的
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828;Q78

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