奶牛卵巢静止血液蛋白标识物的筛选及其预警体系的建立

发布时间：2020-05-19 09:18

【摘要】：近年来,我国集约化牛场高产奶牛产后能量负平衡较为普遍,卵巢静止性乏情率较高,严重影响奶牛繁殖性能,降低了奶牛生产性能和经济价值。然而,目前高产奶牛产后能量负平衡导致卵巢静止发生的蛋白组学机制不明,并缺乏相应的预警技术。因此,本研究应用蛋白质组学开展卵巢静止奶牛血液蛋白标识物的筛选及关键因子的信号通路研究,旨在揭示所获得的蛋白在卵巢静止发生中的作用,为建立该病风险预警体系奠定基础。本实验选取产后14-21天能量正平衡(PEB)和能量负平衡(NEB)荷斯坦奶牛,跟踪至其产后60-90天,通过发情表现、直肠检查和B超检查后,按判定标准将实验奶牛分为卵巢静止组(IO),正常发情对照组(CON),每组50头采集血清。另外,在屠宰场收集来自同品种、背景相近、无繁殖疾病、产后健康的经产奶牛卵泡颗粒细胞,根据卵泡直径分为三组,大卵泡(L)、中卵泡(M)、小卵泡(S),每组10个样品。此外,在IO组和CON组中,每组随机选取15头奶牛血清用于蛋白质组学实验,另外35头奶牛血清用于ELISA检测的验证实验。试验结果如下:1.应用iTRAQ/LC-MS/MS联用技术筛选出23种与能量负平衡相关的血清差异表达,其中NEB组表达上调的有16种,表达下调的有7种。根据生物信息学结果提示,这些差异表达蛋白多与脂类代谢(APOA1、APOA5、APOF、TTR)、蛋白酶复合体系统(PSMA2、PSMA4、PSMA7 和 PSMB1),及糖酵解(SORD 和 GAPDH)相关;2.经产后60-90天奶牛血液生殖激素分析揭示,能量负平衡能够引起生殖激素分泌紊乱(FSH和E2的浓度降低),是引起奶牛卵巢静止的原因之一;3.应用iTRAQ/LC-MS/MS联用技术对奶牛卵巢静止血清蛋白组学的研究,共获到61种差异表达蛋白。其中与卵巢静止相关的14种差异表达蛋白。经免疫印迹和/或ELISA方法验证的10种差异蛋白中ADIPOQ、IGFBP2和RBP4会通过影响生殖激素生物过程而影响卵泡发育,GPX3会通过氧化应激而影响卵泡发育,且验证结果与组学结果一致;4.为了获得与卵巢静止直接相关的代谢通路及代谢通路的作用机制,实验选取不同大小卵泡研究糖代谢在卵泡颗粒细胞中的作用,发现颗粒细胞内糖酵解的关键限速酶HK、PEK和差异蛋白ALDOB在从小到大的卵泡中先升高再降低,而关键限速酶PKM2和差异蛋白LDHB 一直降低,提示糖酵解在卵泡发育早期发挥作用,且一旦发生紊乱能够成为卵巢静止发生的主要病因之一;5.为了建立卵巢静止的预警体系,实验对产后60-90天IO组和CON组奶牛血液中3种能量指标、4种生殖激素以及10种关键差异表达蛋白,经过相关性分析、二元逻辑回归建模以及ROC分析,建立了基于APOA4和ITIH3的单一指标的预警技术,其预警值分别为APOA428.825 μg/L,ITIH3195.07ng/L;建立了基于APOA4+ITIH3+E2潜在生物标志物的多指标预警体系,其预警值为:APOA447.56μg/L,ITIH4187.80ng/L,E269.63ng/L;6.通过对卵巢静止发生机制的网络构建,提示能量负平衡所致的卵巢静止与机体多种代谢异常相关联,包括脂类代谢、氧化应激、维生素代谢、胰岛素及IGF系统,以及卵丘-卵母细胞复合体的形成等。说明了能量负平衡所致的奶牛产后卵巢静止发生机制的复杂性。结论:1)通过对能量负平衡蛋白组学的分析,提示能量负平衡与脂类代谢、糖类代谢及蛋白酶复合体存在密切相关;2)明确了糖酵解过程在对卵泡发育的作用,推测糖酵解的紊乱时引起卵巢静止的主要原因之一;3)建立了卵巢静止发生风险预警体系,确定了单一指标和多指标的预警值;4)构建了卵巢静止发生的代谢网络图,提示卵巢静止发生的多重病因理论,为今后卵巢静止发生机制和防治的深入研究奠定了基础。
【图文】：

基团,反应基团,同量,异位

ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐ，邋ａｎｄ邋ａ邋ｎｅｕｔｒａｌ邋ｂａｌａｎｃｅ邋ｐｏｒｔｉｏｎ邋ｔｏ邋ｍａｉｎｔａｉｎ邋ａｎ邋ｏｖｅｒａｌｌ邋ｍａｓｓ邋ｏｆ邋１４５逡逑ｉＴＲＡＱ试剂结构为同量异位标签，由带电的报告基团组成，每种试剂中报告基团对应逡逑每一个样品。肽反应基团和中性平衡基团以保持总质量１４５邋（图１－３）。这些独特的试剂在逡逑ＭＳ／ＭＳ碎裂后产生相应的、独特的报告离子（荷质比：四标：１１４－１１７；六标：１１４－１１９：逡逑八标：１１４－１２１），用于量化它们各自的样品。ＭＳ／ＭＳ碎裂除了提供强烈的报告离子信号逡逑夕卜，还可以产生ｙ－和ｂ－离子，而不会改变任何特定肽的电荷状态，从而在定量的同时可以逡逑更可靠的鉴定蛋白质。逡逑肽反应基团设计为能够与所有伯胺进行反应，包括赖氨酸侧链的Ｎ－端和ｅ－氨基基团，逡逑以在多种不同生物样品中标记所有肽，从而增强任何给定蛋白质的肽覆盖，同时允许保留逡逑其他重要的结构信息，例如翻译后修饰。逡逑１１逡逑

多重反应,试剂,方案

逡逑图１－４以４标为例的ｉＴＲＡＱ试剂的工作流程，每个单独的样品被还原、烷基化，并用逡逑胰蛋白酶进行酶促消化，然后将得到的肽池分别在一组平行的反应中标记、合并，然后通逡逑过液相－质谱／质谱（Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，，邋ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）逡逑联用的方法进行分析。所获得的混合物在ＭＳ中产生一组未处理的前体离子，进而达到对逡逑样品中低丰度蛋白的增强作用。在ＭＳ中产生的亲本片段经过处理后，四个报告基团离子逡逑在荷质比１１４－１１７之间显现为不同的质量。逡逑￣＞？邋ＥＩＭｉ］－ｐＴＣ邋＋逡逑‘各 …口量镇逡逑——＾逦Ｊ邋－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－Ｂａｌａｎｃｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＩＮＴＡＣＴ逦－邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ＥＱＵＡＬ逡逑－邋４邋ｓａｍｐｔｅｓ邋ｉｄｅｎｔｉｃａｌ邋ｍ／ｚ逦－邋Ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｉｏｎｓ邋ＤＩＦＦＥＲＥＮＴ逡逑图１－４四标试剂的多重反应方案逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋（Ｓ１－Ｓ４），逡逑ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｌｏｕｒｓ．逡逑ｉＴＲＡＱ试剂拓展了研究蛋白质差异表达的动态能力，它能提供多种样本中蛋白的定量逡逑信息，包括时间过程分析及疾病标记的发现和阐明。由于样本中的大多数肽都适用于该标逡逑记策略
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

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