新型鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2020-05-19 21:29

【摘要】：新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)是一种能够引发鸭的“喙萎缩-侏儒症(beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS)”的病原,该病能导致番鸭大舌且短喙、生长缓慢或侏儒。NGPV多导致10-30 d龄左右的肉鸭感染,虽然死亡率与发病率较低,但是导致我国养鸭业残鸭、僵鸭高达60%左右的淘汰率,使国产鸭业经济损失重大。新型鹅细小病毒的VP3蛋白含有病毒的主要抗原决定簇,构成该病毒的主要抗原表位,而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主细胞的过程中都起着重要作用。本研究用PCR方法扩增NGPV的VP3基因,然后连接到原核表达载体pCold-TF上,转化入E.coli BL21感受态细胞,成功构建VP3基因表达载体pCold-VP3,高效表达重组蛋白VP3;并利用His标签纯化的方法得到高纯度的重组蛋白VP3;该蛋白在E.coli BL21细胞中以可溶性形式表达;VP3蛋白分子量大小为110 kDa,Western blot和间接免疫荧光鉴定结果表明重组蛋白VP3可与新型鹅细小病毒的特异单抗发生特异性免疫反应,表明原核表达的重组蛋白VP3具有良好的免疫原性,从而筛选出免疫效果好的单抗1-5和单抗1-7,这两种单抗可以高效鉴定NGPV,为以后开发ELISA诊断试剂检测NGPV奠定有利基础。根据NCBI基因库中VP3基因序列,对VP3基因的内部片段进行PCR扩增,得到分子量为143bp的VP3基因片段,以pMD19-T质粒为载体,成功构建重组质粒pMD19-143。将阳性质粒作为模板建立实时荧光定量PCR标准曲线、进行特异性检测、敏感性检测和重复性检测试验。研究结果表明,荧光定量的反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s,60℃延伸34 s,40 cycles,上下游引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.8μmol/L时,荧光定量效果最佳。本研究建立的NGPV的荧光定量PCR的标准曲线的线性关系相关系数均在0.990以上;检测敏感性达到37.2拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍,具有良好的特异性;批内和批间的重复性检测变异系数均小于2.2%,重复性好;因此利用荧光定量PCR方法检测新型鹅细小病毒,敏感性明显高于普通常规PCR方法。该方法具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可初步用于NGPV疫情的快速诊断。
【图文】：

25源新型鹅细小病毒 VP-1 PCR-amplified E g质量标准(DL2000)rker(DL2000); 1:PCR大小为 2000 到 10，与预期片段大小Cold-VP3 的鉴定体 pCold-VP3 用内，，电泳结果(见图

2 重组质粒 pCold-VP3 双酶estion identification of the rec标准（DL5000、DL2000） Marker;1:pCold- VP3 Bienz小为 1000 bp 到 2000 b亮条带。通过对处于 20，与目的基因 VP3 基因及 SDS-PAGE 分析-VP3，转化 BL21 大肠杆液体培养基里加 IPTG 诱菌感受态细胞。将两种培 凝胶电泳，SDS-PAGE
【学位授予单位】：内蒙古师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2671514