基于牛和马鼻咽部的RNA-seq揭示其感染口蹄疫病毒的机制

发布时间：2020-05-19 22:11

【摘要】：口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度传染性疾病。口蹄疫的爆发使受感染的家畜遭受严重生产损失,是一种在经济上具有毁灭性的疾病,它已经成为国际动物和动物产品贸易的主要障碍。目前,全球有100多个国家仍然受到口蹄疫的影响,口蹄疫已经被列为重大跨国动物疫病的全球消灭计划及生物武器安全公约组织重点检查对象。口蹄疫病毒的感染具有宿主嗜性,包括所有偶蹄类的家畜和野生反刍动物以及猪都会发生疾病或长期携带病毒,而奇蹄类动物并不感染口蹄疫,如马对口蹄疫病毒是具有高度抗性的动物。即使被病毒污染了,也没有疾病的症状和血清型特征。本研究利用全转录组测序技术对牛的易感部位牛鼻咽部和马的鼻咽部在感染口蹄疫病毒前后进行比较研究,以期得到家畜口蹄疫易感性的遗传基础。为寻找口蹄疫的高效的免疫防治方法及利用先进的基因操作技术精确改造家畜的特定基因,改善家畜的抗病性提供新的思路。全文研究结果如下:1.免疫组化检测到牛和马鼻咽部均表达口蹄疫病毒受体—整联素蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8)。2.口蹄疫病毒感染前后,牛鼻咽部转录组测序6个样本的数据总量(clean data)均在12G以上,牛鼻咽部感染组(n=3)和对照组(n=3)比较,差异表达mRNA共有5967个,上调的基因有3261个,下调的基因有2706个。差异表达lncRNA共有143个,上调的有40个,下调的有103个。GO分类结果表明,富集到参与生物过程的基因有4705个;参与细胞组分4788个;参与分子功能5173个?差异表达mRNA转录本共富集得到上调基因显著性通路38条和下调基因显著性通路28条。这些通路与细胞代谢、免疫反应、氨基酸的代谢、蛋白质的转运、溶酶体等生理生化反应有关。3.马鼻咽部感染组(n=3)和对照组(n=3)比较,差异表达mRNA共有8658个,上调的基因有4108个,下调的基因有4550个。差异表达lncRNA共有576个,上调的有410个,下调的有166个。对马鼻咽部差异基因进行GO富集分析,参与生物过程的有1369个;参与细胞组分1440个;参与分子功能1598个?差异表达mRNA转录本共富集得到上调基因显著性通路37条和下调基因显著性通路44条。这些通路与粘附连接、免疫反应、免疫疾病及病毒-宿主反应、溶酶体等有关。4.利用RNA-seq技术对感染前后的牛鼻咽部组织进行small RNA测序,鉴定到已知miRNA成熟体(mature)611个;预测到novel miRNA成熟体(mature)187个;感染组(BMV)和对照组(BM)的差异miRNA个数以及上调(UP)、下调(DOWN)miRNA个数分别为:56,30,26。对检测到的已知miRNA和新miRNA进行家族分析,经聚类分析分为41个簇(cluster)和231个家族(family),利用动物miRNA靶基因预测软件得到了miRNA和靶基因间的对应关系。靶基因的生物学功能及其所富集到的通路显示,其功能主要包括蛋白质的定位、蛋白质运输、胞内运输、细胞代谢过程、细胞外囊泡、上皮细胞的病菌侵入、趋化因子信号、吞噬作用等。此外,对差异表达的miRNA、lncRNA和mRNA数据进行了关联分析。绘制了关键基因IRF8、CYCS、CASP3的调控网络。5.对感染前后马鼻咽部组织进行small RNA测序。鉴定到已知miRNA成熟体(mature)414个;预测到novel miRNA成熟体(mature)175个;感染组(EMV)与对照组(EM)的差异miRNA个数以及上调、下调miRNA个数分别为:180,93,87。对检测到的已知miRNA和新miRNA进行家族分析,经聚类分析分为41个簇(cluster)和207个家族(family),利用动物miRNA靶基因预测软件得到了miRNA和靶基因间的对应关系。靶基因的生物学功能及其所富集到的通路主要包括上皮细胞的病菌侵入、抗原的处理与提呈、肌动蛋白细胞骨架调控、泛素介导的蛋白水解等。对马鼻咽部表达的差异miRNA、lncRNA和mRNA数据进行了关联分析。绘制了关键基因TLR3、TLR4、TLR2、TRAF3、ATG9、GADD45A的调控网络。6.通过生物信息学对表达的差异基因进行分析,我们发现牛咽部在应对口蹄疫病毒时,主要是通过整联素受体传递信号至细胞内,通过焦点粘附信号、细胞骨架信号和MAPK信号通路激活NF-κB,进而激活了炎症介质的释放和免疫反应,细胞骨架通路使细胞渗透性增加,胞内蛋白外泄,病理表现出炎症反应。在病毒清除方面,牛主要依靠线粒体途径发生细胞凋亡,capase3切割激活Gasdermin家族成员Gasdermin E(DFNA5),细胞凋亡转化为细胞焦亡使细胞裂解死亡。同时,病毒对宿主的转录翻译系统进行阻断,使得抗病毒物质的分泌合成减少,病毒能够逃避免疫反应而复制和传播。这些因素共同促成了牛对口蹄疫病毒易感且出现临床症状。虽然马的鼻咽组织中也有整联素受体表达,但马清除病毒和对抗病毒的机制主要是:通过模式识别受体TLR4、TLR3,激活TRAM-TRIF-IRF3通路参与抗病毒反应;在马鼻咽部组织受到病毒刺激时,β-防御素(BD-1)在阻止病毒进入马时发挥着特殊作用;TLR结合配体后,其蛋白构象发生改变,细胞的自噬被激活,自噬可以作为一种防御机制清除病原体;病毒在细胞内合成的蛋白可能通过自噬-溶酶体途径进行降解排出细胞;马的细胞并未发生细胞炎症性死亡且病毒并没有阻断马的转录翻译起始系统。TLR2、TLR3均可以激活TSLP分泌,正常情况下,TSLP通过与树突细胞表面的受体TSLPR(CRLF2)结合,诱导产生Th2介导的炎症反应,但马接触病毒后,由于TSLPR表达沉默,炎症反应并未被诱导。所以我们推测,上述因素共同导致了马是一种具有口蹄疫病毒抗性的家畜。所以,在转录组水平,上述基因表达及其非编码RNA调控因素的不同,使得牛和马在接触口蹄疫病毒时启动了不同应对机制从而表现出不同的易感机制和抗病性能。此外,为了证实测序数据的可靠性,对部分关键基因进行了荧光定量PCR的数据验证,验证结果与测序结果一致。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】