犬瘟热病毒P蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的筛选

发布时间：2020-05-20 00:43

【摘要】：犬瘟热(Canine distemper)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起多种动物共患、多系统感染的高度接触性传染病。为获得CDV野毒株(CDV-PS)截短磷蛋白(aa 232-507),本实验以Asia-1型CDV-PS毒株为基础,经PCR扩增得到P(aa 232-507)基因,连接到原核表达载体pEASY~(○R)-Blunt E1中,构建重组原核表达载体E1-CDV-P。将重组质粒转化到BL21感受态细胞中进行原核表达并对诱导条件进行优化。超声破碎最佳条件下的诱导产物,经离心后对重组蛋白进行可溶性分析,随后用Ni-NTA亲和层析对重组截短P蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果显示:重组P蛋白大小约37 kDa,在IPTG终浓度0.1 mmol/L,诱导时间为8 h时,表达量最高;重组P蛋白以包涵体形式存在,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功纯化出重组截短P蛋白;重组P蛋白具有良好的免疫反应性。本研究成功制备出CDV-PS毒株截短P蛋白,为进一步P蛋白抗原表位的研究和CDV抗体诊断方法的研发奠定基础。为获得抗P(aa 232-507)蛋白的单克隆抗体,本研究用纯化的P(aa 232-507)蛋白免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备了4株抗CDV-PS毒株P(aa233-507)的单抗,分别命名为Pc7,Pc8,Pc11和Pc25。Western blot和IFA鉴定其均能与CDV-PS毒株的P蛋白(aa232-507)特异性反应。但单抗Pc8不特异性识别CDV3疫苗株,说明单抗Pc8所识别的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV3疫苗株之间存在着关键性位点的突变。单抗Pc25不特异性识别CDV-Rockborn疫苗株,说明单抗Pc25的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV-Rockborn疫苗株之间也存在着关键性位点的突变。本研究成功制备出的抗CDV-PS毒株P(aa 232-507)蛋白单克隆抗体,为进一步筛选4株单抗的线性抗原表位奠定基础。为鉴定4株单抗的线性抗原表位,本研究通过肽扫描技术利用间接ELISA方法鉴定Pc7,Pc8,Pc11和Pc25的抗原表位。结果显示单抗Pc7识别的抗原表位是~(238)SHGMGIVAGSTN~(249),单抗Pc8识别的抗原表位是~(264)GPSVSAENVRQ~(274),单抗Pc11识别的抗原表位是~(390)INPELRPIIGR~(400),单抗Pc25识别的抗原表位是~(252)TQSALKSTG~(260)。抗原表位比对分析结果显示,单抗Pc7的抗原表位在多个不同毒株中均有突变;单抗Pc25的抗原表位在Asia-1型(除CDV-ZC;140816外)、America-1型、Europe型毒株的相应抗原表位区域没有突变点,而在Asia-2型和大部分America-2型毒株中均有突变;单抗Pc8的抗原表位在多个毒株中均有突变;单抗PC11所识别的线性B细胞表位在不同的CDV毒株中高度保守。本研究成功筛选了4株单抗所识别的线性抗原表位,为建立CDV的诊断方法奠定了基础。
【图文】：

图 1. 1 CDV 基因组结构模式图（Delpeut et al. 2012）Figure 1.1 CDV structure and genome编码的蛋白大约由 15690 个核苷酸组成，从 3’端至 5’端依次是前导序列H 基因和 L 基因、尾随序列（曹智刚, 2017）。CDV 基因组蛋白 V 和 C，编码 V 和 C 的基因位于磷蛋白基因的内部。白全长由 1 683 个核苷酸组成，其开放阅读框（Open Reading Fra，编码 523 个氨基酸（Campbell et al., 1980）。N 蛋白是 CDV衣壳的 90 %以上，，通过缠绕 CDV RNA 表面，以防 RNA 的分为氨基端的可变区、中间的高度保守区和羧基端的可变区氨基端的 80 个氨基酸残基对于 CDV 进入细胞核是必需的的空间结构区域均存在能被抗 CDV N 蛋白单克隆抗体识别Yi 等（2016）通过 ELISA 实验和肽扫描技术，筛选鉴定出 RSYFDPA360。氨基酸序列比对发现该表位在 CDV 各毒株间

反应性实验盒中阴性对照进行12 % SDS-PAGE 白转移至 NC 膜上，5 %脱脂乳室温封闭孵育；用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 孵育 1 h；用 TBST 洗涤 3 次，每次 1 扩增产物的鉴定 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增条目的条带，大小与预期（预期约为 符。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2671738