中国荷斯坦牛金黄色葡萄球菌诱导型乳腺炎乳腺组织全基因组DNA甲基化分析

发布时间：2020-05-20 05:35

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是诱发奶牛乳腺炎最常见的病原菌之一。由于乳腺炎的感染受到多种因素影响,从多方面探索其遗传调控机制有利于推进提高奶牛乳腺炎抗性的选择育种。DNA甲基化是最为重要的表观遗传调控机制之一,对奶牛健康及生产具有重要影响。本研究在前期建立的S.aureus诱导型乳腺炎模型基础上,对其乳腺组织进行全基因组DNA甲基化分析,探究DNA甲基化对S.aureus诱导型乳腺炎的潜在调控机制。本研究利用甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,Methyl-RAD Seq)对 S.aureus 诱导型乳腺炎动物模型试验组和对照组乳腺组织DNA进行全基因组DNA甲基化测序。采用SOAP软件根据参考基因组对质控后序列进行比对注释,用R包edge分析筛选差异甲基化位点和差异甲基化基因,而后采用R包Enricher对其进行功能富集分析。随后与转录组数据联合分析,筛选差异表达且差异甲基化的基因。用亚硫酸氢盐克隆测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)对筛选的关键差异表达且差异甲基化基因的甲基化水平进一步分析。所得结果如下:1、中国荷斯坦牛全基因组DNA甲基化位点在染色体间非均匀分布,且主要集中于基因间区和内含子内。基因体的甲基化水平显著高于其上下游区域,即DNA甲基化水平在转录起始位点前显著增高并在转录终止位点后显著下降。差异甲基化分析共发现差异CCGG甲基化位点9181个,其中荷斯坦牛S.aureus乳腺炎组相对于健康组,5722个甲基化位点甲基化水平显著上调,2459个甲基化位点显著下调(P0.05,|log2FC|1);发现差异CCWGG甲基化位点1790个,其中1150个显著上调,640个显著下调(P0.05,|log2FC|1)。以基因内所有甲基化位点测序深度总和代表该基因甲基化水平,差异分析得到CCGG型甲基化差异基因363个(236个上调,127个下调),和CCWGG型甲基化差异基因301个(177个上调甲基化和124个下调甲基化基因)(P0.05,|log2FC|1)。GO和KEGG功能分析显示:差异CCGG甲基化基因与疾病免疫应答相关通路紧密相关,比如Toll样受体4信号通路的阳性调节、Th17细胞分化、B细胞受体信号通路以及多条与各种疾病相关的通路。而差异CCWGG甲基化基因则对代谢相关过程具有重要调控作用,比如半乳糖代谢、脂肪细胞中脂肪分解以及淀粉和蔗糖代谢等。2、将全基因组DNA甲基化分析结果与转录组测序结果进行联合分析,发现526个CCGG甲基化和124个CCWGG甲基化差异基因的基因表达水平同时显著差异(P0.05)。功能富集分析表明:差异表达的CCGG甲基化差异基因与细胞黏附、细胞迁移及疾病免疫应答调控等密切相关,进一步证明差异CCGG甲基化基因对S.aureus乳腺炎的免疫应答具有调控作用。3、根据上述分析筛选出对S.aureus乳腺炎具有调控潜能的关键差异甲基化基因CDH13、CXCRl、EPO 和 METTL13。CDH13 启动子区、CXCR1、EPO 和 METTL13编码区各预测到一个CpG岛,分别检测到13、16、16和33个CpG位点。其中,S.faureus乳腺炎组CXCR1编码区519 bp处的CpG位点甲基化水平显著低于对照组,其基因表达量显著上调12倍,且该位点甲基化水平与其基因表达水平显著负相关(P0.05)。CDH13启动子区三个CpG位点(-162、-133和-93)的甲基化水平与其基因表达水平显著负相关,但是在S.aureus乳腺炎组与对照组之间差异不显著。另外,CXCR1基因编码区甲基化较高(90%),而EPO和METTL13基因甲基化水平很低(5%),与全基因组测序分析结果一致,验证了全基因组DNA甲基化测序分析结果的准确性与可靠性。综上所述,本研究从表观遗传组学的角度建立了中国荷斯坦牛S.aureus诱导型乳腺炎乳腺组织全基因DNA甲基化图谱,筛选了S.aureu 乳腺炎相关的差异甲基化基因并进行功能分析,差异CCGG甲基化基因在S.aureus乳腺炎的免疫应答中起重要调控作用。CXCR1编码区519 bp处CpG位点甲基化水平降低促使其基因表达水平升高,这可能对S.aureus乳腺炎过程起调控机制。该结果为提高中国荷斯坦牛S.aureus乳腺炎抗性的表观遗传调控以及分子辅助选择育种提供了科学依据。
【图文】：

Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化标签测序文库，测序结果共产生８邋１２５邋６８５条ｒｅａｄｓ，平均测序逡逑ｒｅａｄｓ邋数为邋１３邋５２０邋９４８邋条（表邋２－３邋）。逡逑质控后各样本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的碱基分布如图２－３所示，各个位置上出现Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／Ｎ的逡逑比列表明测序所得ｒｅａｄｓ均具有明显的Ｇ／Ｃ富集峰值。各个样本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的测序质量分逡逑布如图２－４所不，Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的碱基质量分数均较高（质量分数彡３５），且质控后Ｅｎｚｙｍｅ逡逑Ｒｅａｄｓ中高碱基质量的ｒｅａｄｓ比例高达９９％邋（表２－３邋）。且经过质量控制后的各个文库的逡逑Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ均占测序ｒａｗ邋ｒｅａｄｓ的９９％以上

逦９０逦５．２７逡逑图２－２全基因组ＤＮＡ凝胶电泳图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｗｈｏｌｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ＤＮＡ逡逑２．３．２邋Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化标签测序文库数据产出逡逑通过Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ技术构建了邋Ｓ．ａｗｒｅｗ诱导型乳腺炎试验组和对照组共６个逡逑Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化标签测序文库，测序结果共产生８邋１２５邋６８５条ｒｅａｄｓ，平均测序逡逑ｒｅａｄｓ邋数为邋１３邋５２０邋９４８邋条（表邋２－３邋）。逡逑质控后各样本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的碱基分布如图２－３所示，，各个位置上出现Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／Ｎ的逡逑比列表明测序所得ｒｅａｄｓ均具有明显的Ｇ／Ｃ富集峰值。各个样本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的测序质量分逡逑布如图２－４所不，Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的碱基质量分数均较高（质量分数彡３５），且质控后Ｅｎｚｙｍｅ逡逑Ｒｅａｄｓ中高碱基质量的ｒｅａｄｓ比例高达９９％邋（表２－３邋）。且经过质量控制后的各个文库的逡逑Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ均占测序ｒａｗ邋ｒｅａｄｓ的９９％以上，含有预期酉每切位点的Ｅｎｚｙｍｅ邋Ｒｅａｄｓ占Ｃｌｅａｎ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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本文编号：2672148