MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-20 04:54

【摘要】：MLKL是一种假激酶蛋白,最初作为RIPK3的特异性底物被发现,是目前发现介导细胞坏死性凋亡信号的最下游效应分子。由于MLKL的N端四螺旋束功能区具有与生物膜结合并介导生物膜打孔或透化的特性,因此MLKL被认为是细胞发生坏死性凋亡的执行者。目前,关于MLKL生物学功能的报道主要集中于细胞死亡领域,其介导的细胞坏死性凋亡参与金黄色葡萄球菌的局部和全身性感染以及某些自身炎症性疾病的发生。然而,MLKL是否参与调节肠道黏膜屏障功能并不清楚。沙门菌感染引起的肠炎严重危害畜牧业发展和人类健康,是全球重要的公共卫生问题。研究调节肠道黏膜免疫反应的分子机制,找到干预靶标,有利于沙门菌感染性肠炎的防控。本论文对MLKL在宿主防御沙门菌黏膜感染中的作用和机制进行了较为深入的研究。利用WT和MLKL~(-/-)小鼠构建沙门菌感染性肠炎模型,首先分析MLKL是否影响宿主对沙门菌的易感性。结果发现,与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠对沙门菌黏膜感染更为易感,主要表现为小鼠存活率显著降低、体重减轻更为明显,且在沙门菌感染48h后,伴有以盲肠重量减轻、杯状细胞减少、黏膜下层水肿明显、肠上皮完整性破坏明显、大量的炎性细胞浸润以及炎性介质产生等为主要特征的肠道病理损伤。由于沙门菌经消化道进入宿主体内后,突破肠道黏膜屏障并扩散至系统位点,引起宿主的胃肠炎、败血症及全身性感染(伤寒症)等。因此,我们推测沙门菌感染后MLKL~(-/-)小鼠体现的严重肠道炎症和全身症状可能伴随细菌的大量定殖,实验证实沙门菌感染48h后,MLKL~(-/-)小鼠盲肠组织和肠系膜淋巴结(肠道位点)与肝脏和脾脏(系统位点)均定殖了大量的细菌。总之,沙门菌感染后,MLKL~(-/-)小鼠存活率降低,组织损伤严重,炎性反应加剧,沙门菌入侵和扩散增多,说明MLKL有助于机体抗沙门菌黏膜感染。肠道黏膜屏障功能的完整性在防御肠道病原入侵和扩散中起重要作用。为了探究MLKL是否通过促进黏膜屏障功能完整和维护肠道稳态实现其抗感染作用,我们进行如下实验:首先,通过AB-PAS染色和免疫组织化学方法检测盲肠组织中黏蛋白的表达情况。结果发现,在沙门菌感染48h后,与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲肠组织中黏蛋白的表达显著减少,且粘液的主要组成成分mucin 2表达也显著减少,说明MLKL缺失导致肠道黏膜化学屏障受损更严重。肠上皮细胞的更替(增殖和凋亡)也是维护肠道组织平衡和屏障功能的要素,通过免疫荧光和TUNEL染色发现,在沙门菌感染48h后,尽管两种基因型小鼠肠上皮细胞的增殖无明显差异,但MLKL~(-/-)小鼠肠上皮细胞的凋亡明显增加,说明MLKL信号参与调节组织平衡以维持肠道黏膜层的完整,进而限制沙门菌的入侵。此外,通过实时荧光定量PCR、免疫组织化学和免疫蛋白印迹检测盲肠组织中紧密连接蛋白的表达情况。结果发现,在沙门菌感染48h后,尽管两种基因型小鼠盲肠组织中occludin和ZO-1的表达无明显差异,但与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲肠组织中claudin-3的表达显著减少。与此同时,在体应用葡聚糖荧光探针检测肠道渗透性的变化情况,发现在沙门菌感染48h后,与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠肠道的渗透性显著增加,说明MLKL~(-/-)小鼠的肠道黏膜屏障功能更易被破坏。上述结果表明,在MLKL基因缺失后,肠道黏膜屏障功能和肠道稳态更易被沙门菌所破坏。然而,上述结果还不能准确揭示MLKL的保护机制,例如不能明确脆弱的肠道黏膜屏障、过度的炎症和增多的入侵沙门菌之间的因果关系,因此进行沙门菌急性感染实验。结果发现,在沙门菌感染6h后,与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠肠道位点的细菌定殖数量有明显的增加趋势,然而两种基因型小鼠的肠炎并不显著,且黏蛋白的表达也无明显差异。尽管感染后MLKL~(-/-)小鼠盲肠组织中claudin-3的表达减少,但在未感染状态下,两种基因型小鼠盲肠组织中claudin-3的表达并无明显差异。这些结果说明MLKL主要通过限制沙门菌在肠道黏膜的早期定殖,从而阻止肠道黏膜屏障功能和稳态的破坏、抑制过度炎症和阻止细菌向系统位点的扩散,起到抗沙门菌黏膜感染作用。MLKL如何限制沙门菌的早期定殖,是我们需要探究的新问题。首先,应用免疫组织化学方法分析MLKL的表达定位,发现在沙门菌感染后,p-MLKL主要表达于肠隐窝处的上皮细胞和浸润的炎性细胞。肠上皮细胞和浸润的单核巨噬细胞等炎性细胞均是肠道黏膜天然免疫的结构基础,表达多种模式识别受体(PRRs)识别病原和介导免疫应答反应,是构成肠道黏膜免疫的第一道防线。然而,通过构建WT/MLKL~(-/-)骨髓嵌合体小鼠,发现主要是肠道黏膜非造血细胞(肠上皮细胞)表达的MLKL限制沙门菌的早期定殖。近年来,炎性体是天然免疫研究领域的前沿课题,相继发现肠上皮细胞表达的NLRP3、NLRC4和NLRP9b等多种炎性体在防御肠道病原如细菌、病毒或寄生虫等感染中发挥重要作用,因此我们分析MLKL介导的抗感染保护作用是否依赖于炎性体信号。结果发现,在沙门菌感染6h和48h后,与WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲肠组织中炎性体信号被显著抑制。同时,在MLKL基因缺失后,盲肠组织中炎性体活化依赖的IL-18分泌也显著减少,回补外源的IL-18重组蛋白可显著降低MLKL~(-/-)小鼠肠道位点和系统位点的沙门菌定殖数。上述结果说明肠道黏膜非造血细胞(肠上皮细胞)表达的MLKL通过促进炎性体信号活化,起到限制沙门菌在肠道黏膜早期定殖的作用。综上所述,本论文证明了坏死性凋亡信号的效应分子MLKL通过促进肠道黏膜非造血细胞(肠上皮细胞)炎性体信号活化,限制沙门菌在肠道黏膜的早期定殖,并维护肠道稳态和抑制感染性肠炎,从而实现其抗感染保护作用。
【图文】：

沙门菌,途径,吞噬细胞,黏膜

图 1.1 沙门菌突破肠道黏膜屏障的途径引自 Anna Fa0brega, et al. (2013).门菌穿过肠道黏膜后，其会被吞噬细胞所吞噬。目前的研究表

结构示意图,被动转运,选择性渗透,主动转运

物的入侵以及有害物质的吸收；同时，肠道黏膜屏障可通过选择性渗透和转运，以吸收营养物质。肠道黏膜屏障主要由细胞组分、细胞间组分以及非细胞组分（主动转运、被动转运和分泌生物活性物质）构成，以维持其功能的完整性（图2.1）。图 2.1 肠道黏膜屏障的结构示意图引自 Mélanie Le Barz, et al. (2015).
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.1

【参考文献】