纤维素酶系在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及高效协同作用的研究

发布时间：2020-05-20 12:54

【摘要】：近年来,畜牧行业发展迅速,导致饲料资源越来越匮乏,人畜争粮问题越来越严重,饲料资源已成为阻碍养殖业持续健康发展的一个重大问题。然而有一类主要成分为木质纤维素的农作物副产品资源十分丰富,但是这类含有木质纤维素的植物,因其细胞壁难以降解,造成了自然界中大量的纤维素资源没有在畜牧行业中得到广泛应用,甚至造成环境污染。将木质纤维素分解为可以被消化吸收的营养成分,依赖于纤维素酶系对底物的协同降解。本论文围绕产纤维素酶芽孢杆菌的筛选,纤维素酶基因的克隆,枯草芽孢杆菌信号肽的系统性筛选,纤维素内切酶、纤维素外切酶和木聚糖酶的分泌表达,以及多酶协同与多酶复合体协同降解天然纤维素效果进行了研究。结果如下:1采用刚果红染色法从腐殖质中分离获得一株产纤维素酶的芽孢杆菌(Bacillus sp),经革兰氏染色和16s rDNA序列比对分析,分离获得的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),将其命名为B.subtili ZC-5。B.subtili ZC-5培养24 h产酶活性最高达到3.22U/mL。B.subtili ZC-5的纤维素酶的最适反应温度为50℃-60℃,最适pH为pH6-pH7。该酶不耐受高温。不同纤维来源对B.subtili ZC-5产纤维素酶活力有影响,培养基中添加燕麦青干草时B.subtili ZC-5纤维素酶活最高(4.21U/mL)。2从B.subtili ZC-5基因组DNA中克隆获得纤维素内切酶基因cen ZC-5。cen ZC-5全长1.5 kb,编码55个氨基酸,其编码蛋白的N端30个氨基酸为信号肽。cen ZC-5的序列与Bacillus subtilis纤维素内切酶基因序列的相似性达到94%,cen ZC-5编码蛋白与Bacillus subtilis的纤维素内切酶具有很高的相似性。在大肠杆菌中进行cen ZC-5原核表达,验证了该基因编码蛋白的纤维素酶活性。3构建了E.coli-B.subtilis穿梭质粒载体pCBS。基于pCBS和木聚糖酶基因xynBYG,分别构建获得信号肽筛选载体pP43-xynBYG和pPglvm-xynBYG。从B.subtilis1A747基因组中扩增获得138个信号肽编码基因,获得114个信号肽筛选表达载体pGS-pGS 114、114个信号肽筛选表达载体pP43S1-pP43S114、24个信号肽筛选表达载体pGT1-pGT24和24个信号肽筛选表达载体pP43T1-pP43T24。以B.subtilis WB700为宿主进行276个信号肽介导的分泌表达检测。结果显示,信号肽Sec途径信号肽PhoB、YhfM,YpjP和CotC展现了高分泌表达水平,木聚糖酶酶活高于150 U/mL。含Tat途径信号肽的分泌表达重组菌中,信号肽LipA的酶活最高,大部分Tat途径信号肽的酶活低于0.1 U/mL。4对信号肽的氨基酸残基性质和相应分泌表达量进行分析。结果显示,氨基酸疏水性、螺旋倾向性指数、螺旋含量指数、侧链θ角度指数、螺旋稳定性指数、氨基酸残基跨膜指数、双氨基酸残基转角倾向指数和信号肽D-score等指标和分泌表达量呈强相关性。LPS分析显示,7个氨基酸指数和信号肽D-score对分泌表达量变异的贡献率为23%,其中螺旋倾向性指数,氨基酸残基跨膜指数和D-score是3个重要的独立变量。采用同样的分析方法分析这8个变量(7个氨基酸指数和信号肽D-score)和角质酶分泌表达的关系。结果显示,这8个变量对角质酶分泌表达量变异的贡献率为18%,氨基酸残基跨膜指数和D-score是2个重要的独立变量。PLS预测的模型和木聚糖酶表达量的测定值之间具有强相关性(PCC=0.54)。5构建了含自身信号肽的cen ZC-5分泌表达载体pCEN,phoB介导的cen ZC-5分泌表达载体pPhoB-CEN。合成Clostridium thermocellum多酶复合体中纤维素酶组分的锚定域蛋白(Dockerin)的编码基因Ctdoc,构建3’端嵌合Ctdoccen的重组基因cenZC-5doc,并构建了cenZC-5doc分泌表达载体pCENdoc。分泌表达检测显示,在12h、24h、36h和48h,B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的分泌表达水平依次是WB700(pCEN)的1.56、1.44、1.37和1.25倍。B.subtilis WB700(pCendoc)在24h和36h的分泌表达水平依次是B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的84.68%和8427%。6合成嵌合了Clostridium cellulolyticum纤维素Dockerin的编码基因Ccdoc的重组纤维素外切酶cbhAdoc,并构建分泌表达载体pCBdoc。构建嵌合了Rumincoccus flavefaciens Dockerin的编码基因Rfdoc的重组木聚糖酶xyn BYGdoc,并构建分泌表达载体pXYNdoc。设计合成含Clostridium thermocellum纤维素结合域(CBM)和粘附域(Cohesin),Clostridium cellulolyticum Cohesin和Rumincoccus flavefaciens Cohesin的脚手架蛋白(Scaffoldin)基因scafCCR,并构建分泌表达载体pScaf。分泌表达检测显示,cbhAdoc在B.subtilis WB700中的分泌表达水平在24h达到最大为1.59U/mL。重组木聚糖酶Xyn BYGdoc在24h的分泌表达水平达到最大为302.11U/mL。在24h和48h,重组木聚糖酶(xyn BYGdoc)的分泌表达量为木聚糖酶(xyn BYG)的81.56%和76.24%。7为检测不同酶协同降解效果,采用B.subtilis WB700分泌表达的CenZC-5doc和CbhAdoc共同处理燕麦青干草时,在24h、48h和72h还原糖的产量均高于CenZC-5doc或CbhAdoc单独处理燕麦青干草。采用B.subtilis WB700分泌表达CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解燕麦青干草2h、48h和72h,还原糖的产量显著的高于CenZC-5doc和CbhAdoc共同降解燕麦青干草的还原糖产量。CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解24h、48h和72h的还原糖的产量分别是是CenZC-5doc和CbhAdoc双酶共同降解的1.38倍、1.42倍和1.17倍。纯化B.subtilis WB700分泌表达CenZC-5doc,CbhAdoc,Xyn BYGdoc和ScafCCR,在体外孵育组装多酶复合体,多酶复合体降解燕麦青干草产生的还原糖量在24h、48h和72h均高于CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc的3酶混合物共同降解产生的还原糖量。
【图文】：

图 1-1 纤维素多酶复合体示意图Fig1-1 Modular architecture of the cellulosomeCellulosome 的优势不仅在于多酶系的聚集复，该复合体还会发生动态聚合。早 年就通过 TEM 发现在用非溶性纤维素培养产生的纤维素酶多酶复合体能够聚合径为 60～200nm 的多聚 Cellulosome (Bayer et al. 1998)。在形成多聚 Cellulosome两个不同类型的 Cellulosome 能够形成二聚体。分析 Cellulosome 结晶结构发losome 能够通过其 Scaffold 蛋白 I 型 cohesin 与其他 Cellulosome 的 Scaffold 蛋

（Cohesin-Dockerin）相互作用形成的。Cohesin-Dockerin相互作用将纤维素酶分子结合到Scaffold上，并且可以通过不同Scaffold的Cohesin-Dockerin相互作用，连接组装成更加复杂的Cellulosome（图1-2）。Cellulosome可以通过Cohesin-Dockerin特定相互作用将Cellulosome连接到细胞表面（图1-3），从而将多个酶分子组装成复合体(Tokatlidis et al. 1991; Tokatlidis et al. 1993; Salamitou et al. 1992)。人们很早以前对热纤梭菌中纤维素酶多酶复合体进行生化分析时，发现存在一种异常强烈的蛋白相互作用(Fierobe et al. 1999)。后续分析证实粘附蛋白与锚定蛋白的相互作用的确是高亲和性的相互作用，据估计，解离常数(KD)约为10-9-10-12mol/L，或者更低(Fierobe et al.2001; Mechalyet al. 2001; Yaron et al. 1995; Lytle et al. 2000)。图1-2 多聚Cellulosome示意图Fig1-2 Heterodimeric CellulosomeCellulosome中Scaffold的粘附蛋白（Cohesin）通常成串排列，在Cellulosome的组装中发挥重要作用。Scaffold的Cohesin数量在1-11个之间，，通常情况下都大于4个(Doi et al.2004)。来源于C. thermocellum的Cellulosome，Scaffold包含九个相似的Cohesin
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S816

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本文编号：2672650