猪C1QBP在PRRSV诱导的炎症反应中的潜在作用

发布时间：2020-05-21 00:30

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种急性、高度接触性的病毒性传染病。PRRSV感染可造成严重的间质性肺炎、血管炎、心肌炎和脑炎等,典型症状表现为妊娠母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸困难和生长迟缓。目前已知在PRRSV感染部位可释放大量的炎症因子(如IL-6、IL-8、TNF-α等),并释放某些蛋白质参与免疫炎症反应,这暗示炎症反应在PRRSV感染和致病机制中发挥重要作用。已有研究表明,PRRSV感染PAM和MARC-145细胞能够促进高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的分泌表达,进而增强PRRSV诱导的炎症反应,这也提示某些分泌蛋白与PRRSV的免疫调节反应过程密切相关。C1QBP(complement component 1,q subcomponent binding protein)是补体分子C1q结合蛋白,能够与C1q的球状头部结构域结合,表达于多种组织和细胞(如上皮细胞、淋巴细胞、树突状细胞和血小板等)。最初发现C1QBP主要定位于线粒体基质,后发现在细胞膜、细胞核也有定位,同时也可分泌至细胞外。另外,C1QBP是一个多配体结合蛋白,能够与病原微生物相关蛋白、细胞蛋白和血浆蛋白等结合,广泛参与炎症及感染进程。但C1QBP在PRRSV诱导的炎症反应中的作用尚不清楚,因此我们检测了原核/真核表达的猪源C1QBP蛋白对PRRSV诱导的炎症因子产生的影响,具体研究内容如下:1.猪C1QBP的序列分析对来源于不同物种的C1QBP的氨基酸序列比对分析发现,猪C1QBP与鼠的同源性为93.6%,与人C1QBP的同源性为83.3%。进化树分析表明猪源C1QBP与鼠源C1QBP在进化上位于同一个大的分支上,并单独属于一个小分支。2.猪C1QBP的原核表达与纯化将扩增获得的猪源C1QBP基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建了表达猪源C1QBP蛋白的原核表达质粒pET-28a-C1QBP。将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,证实猪源C1QBP蛋白获得了高效表达,大小约35kDa,并主要以可溶性形式存在,经镍柱纯化获得浓度为0.5mg/mL的纯化蛋白。利用内毒素去除试剂盒去除纯化蛋白中的内毒素,去除效率达50%左右。MTT实验检测发现重组蛋白C1QBP在低于80μg/mL时对细胞的活性无明显影响。3.原核表达并纯化的猪C1QBP蛋白诱导炎症因子的产生将原核表达并纯化的猪C1QBP蛋白处理PAM细胞,通过荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES等炎症因子mRNA水平的表达,结果C1QBP处理后能够促进炎症因子的表达。进一步通过Western blot和IFA检测发现,C1QBP处理PAM细胞能上调p65的磷酸化水平并促进其转位入核。以上结果表明原核表达纯化的猪C1QBP蛋白具有促炎性因子产生的作用。4.干扰C1QBP抑制LPS/PRRSV诱导的炎症因子的产生将C1QBP的干扰分子转染PAM细胞,再用LPS刺激或用PRRSV感染,通过荧光定量检测干扰C1QBP对LPS/PRRSV诱导的炎症因子产生的影响,结果显示干扰C1QBP能够抑制LPS/PRRSV诱导的炎症因子的产生。5.PRRSV感染促进C1QBP的分泌表达且不改变其线粒体定位对实验室前期PRRSV感染MARC-145细胞的分泌蛋白质组学数据分析,发现C1QBP显著上调,于是利用Western blot检测了PRRSV感染MARC-145/PAM细胞后不同时间点细胞内和上清中C1QBP的表达情况,结果显示PRRSV感染后细胞内C1QBP表达量变化不明显,而上清中C1QBP的量显著增多,说明PRRSV感染确实能够促进C1QBP的分泌表达。通过间接免疫荧光实验检测发现PRRSV感染不改变C1QBP的线粒体定位。6.表达的猪C1QBP增强PRRSV诱导的炎症反应用原核表达并纯化的C1QBP蛋白处理PRRSV感染的MARC-145和PK-15~(CD163)细胞,荧光定量检测炎症因子转录水平的变化,结果发现C1QBP能够增强PRRSV诱导的炎症因子mRNA水平的表达,荧光素酶报告系统和Western blot检测发现原核表达的C1QBP能够增强PRRSV诱导的NF-κB激活和p65磷酸化。进一步利用哺乳动物细胞HEK-293T和昆虫细胞Sf9表达了猪C1QBP蛋白,将其纯化后处理PRRSV感染的PAM细胞,荧光定量检测发现HEK-293T细胞和Sf9细胞表达的C1QBP蛋白均能增强PRRSV诱导的炎症因子表达。
【图文】：

基因组结构

性和持续感染性给临床上PRRS的防治带来了巨大的挑战（Chun PRRSV 的病原特性RRSV 不分节段，有囊膜，为单股正链 RNA 病毒（Conzelmann 尼多病毒目的动脉炎病毒科动脉炎病毒属（Cavanagh 1996）。病径 55~60nm，核衣壳呈现不对称的线性排列（Dokland 2010）。病敏感，但不耐碱，一般的消毒剂都可以杀灭该病毒，在空气中可感染力（陈元庆等 2009）。PRRSV 只能在少数几种细胞上增殖V 能在猪肺泡巨噬细胞上生长，，后来证实该病毒也能在非洲绿猴肾、公猪的睾丸细胞等细胞上增殖（Molitor et al 1997）。 PRRSV 的分子生物学研究RRSV 基因组全长约 15kb，由至少 10 个开放阅读框（open reading Conzelmann et al 1993），两个相邻的开放读码框之间都有部分重，具体的基因结构如图 1-1 所示。

示意图,病毒颗粒,示意图,宿主

PRRSV 与炎症反应 PRRSV 入侵机体的过程中，宿主的免疫系统发挥了重要作用，因此学者了关于 PRRSV 免疫学方面的研究。HP-PRRSV 感染可激发宿主的免疫炎引起严重的间质性肺炎（Gómez-Laguna et al 2010，Morgan et al 2016）。据RRSV 感染的猪体内 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 等炎症因子水平显著升高（014，Chen et al 2014，Liu et al 2015）。此外，研究发现 HP-PRRSV 基因组 R导 PAM 细胞炎性小体的激活和 IL-1β 的分泌，这与 PRRSV 的持续性感染制密切相关（Lunney et al 2010b，Chen et al 2018）。另一方面，HP-PRRSV过其编码的蛋白质抑制宿主的先天免疫，损伤 PAM 细胞而阻断局部免疫V 感染常使宿主对其他病原体更易感，如 2 型猪圆环病毒（porcine circovi，PCV2）、经典猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、猪链球菌、杆菌、猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体等，这些继发感染的病原体也可以图 1-2 PRRSV 病毒颗粒示意图（Music and Gagnon 2010）Fig. 1-2 The sketch of PRRSV particle
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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