一种蜱源性粪产碱杆菌IMH株的分离鉴定及其主要毒力因子的预测分析

发布时间：2020-05-21 03:42

【摘要】：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis,A.faecalis)是产碱杆菌属(Alcaligenes)的一类亚群。近些年来,有研究表明,该菌所含的胞外丝氨酸蛋白酶(Extracellular serine protease,Esp)对昆虫的体壁具有溶解作用,特别是对线虫具有毒杀作用,因此粪产碱杆菌被认为具有作为生物制剂的潜力。本研究从内蒙古呼伦贝尔地区自然放牧的羊群中采集硬蜱样本,分离出可疑细菌,并采取常规方法和分子生物学方法对其进行种型鉴定及相关毒力因子的检测与分析。具体研究内容如下:1.A.faecalis IMH的分离与鉴定试验蜱虫经研磨完全破碎后,沾取破碎组织液接种于LB高盐琼脂培养基进行细菌分离培养,并通过革兰氏染色及生理生化等常规试验方法鉴定出一株A.faecalis,这与分子鉴定结果相吻合,该分离株菌的16S rRNA基因序列与GenBank上的粪产碱杆菌的相同基因的相似度为99%。根据16S rRNA基因绘制的系统发育树可看出,本试验分离株与分离自墓土的Alcaligenes sp.CSB1(注册号:KX289442.1)遗传距离近,处在相同分支。本试验成功分离出一株新的蜱源性粪产碱杆菌,命名为Alcaligenes faecalis IMH(简称为A.faecalis IMH),其16S rRNA基因注册于GenBank中,注册号为:LC213619.1。2.A.faecalis IMH的培养特性及生化试验对A.faecalis IMH的溶血特性、药物敏感性试验分析结果表明,该分离株对绵羊血细胞有溶血现象,对庆大霉素、红霉素、头孢噻肟、阿莫西林、环丙沙星敏感,但是对复方新诺明、卡那霉素、链霉素、青霉素、两性霉素B呈现出耐药性。另外,该分离株具有运动性并可在含有10%的NaCl的培养基中生长,呈现出高度耐盐的特性。在糖类发酵试验中,该分离株对蔗糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖等糖的分解试验结果显示阴性,并且吲哚试验、硝酸盐(还原)试验、明胶液化试验等结果仍显示为阴性;而脲酶试验、氧化型与发酵型试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、氧化酶试验结果则显示为阳性。3.A.faecalis IMH对小鼠的致病性试验A.faecalis IMH对小鼠致病性试验结果显示,腹腔注射高剂量菌液1.0×10~(11)CFU/mL的小鼠在感染约15 h后出现短暂性失明现象,小鼠表现出程度不同的精神抑郁,食欲减退,体温、体重与对照组相比下降明显,在注菌31 h后陆续有小鼠死亡;剖检死亡的小鼠后主要的病理变化显示,小肠出现黄色胶冻样物质,脾脏肿大,脑部有萎缩现象。但是心脏、肝脏、肺脏无明显病理变化。组织切片结果显示,脑局部神经细胞坏死明显,脑膜出血,肝细胞中度肿胀,脾白髓内可见淋巴细胞小灶性核崩解。但是心肌细胞无明显变化。4.A.faecalis IMH的主要致病因子基因的克隆及相关分析对A.faecalis IMH的主要致病因子Esp蛋白质进行预测分析。esp基因长度为2.8kbp,Esp是一种稳定的亲水性蛋白质,其二级结构预测以无规卷曲为主,占总结构的48.97%,α-螺旋占22.26%、延伸链占22.48%、β-转角占6.3%。对比A.faecalis IMH主要致病因子Esp和A.faecalis ZD02主要致病因子Esp两种蛋白质三级结构不同之处,主要差异在96-98、106-111等处为α-螺旋;302-309处为β-折叠;213-219处为无规卷曲。A.faecalis IMH主要致病因子Esp结构功能域预测显示,在63-351位氨基酸为S8家族自转运蛋白超家族和392-917位氨基酸为自身转运蛋白超家族。
【图文】：

菌落形态,分离菌,菌落形态

4.1 细菌的分离和纯培养结果在4% LB 高盐培养基中培养的分离菌，菌落呈灰白色、表面湿润、半透明、略凸起，如图1 所示。图 1 分离菌菌落形态特征Fig.1 Morphological characteristics of colony4.2 细菌形态特征观察结果分离菌经革兰染色法染色后，经显微镜油镜观察，分离菌为革兰氏阴性短杆菌，排列方式为单个或成对排列，如图2 所示。图 2 分离菌染色形态特征(1000×)Fig.2 Morphological characteristics of gram strain(1000×)注：A：分离菌染色；B：金黄色葡萄球菌染色；C：大肠杆菌染色21

分离菌,形态特征,细菌形态特征

4.2 细菌形态特征观察结果分离菌经革兰染色法染色后，，经显微镜油镜观察，分离菌为革兰氏阴性短杆菌，排列方式为单个或成对排列，如图2 所示。图 2 分离菌染色形态特征(1000×)Fig.2 Morphological characteristics of gram strain(1000×)注：A：分离菌染色；B：金黄色葡萄球菌染色；C：大肠杆菌染色21
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】