CD28和4-1BB转基因猪的构建及其抗病功能研究

发布时间：2020-05-21 10:37

【摘要】：T细胞免疫应答在宿主抵抗胞内病原感染过程中扮演重要角色,同时对B细胞的效应功能发挥重要的调节作用。T细胞完全活化不仅依赖于MHC-抗原肽-TCR介导的抗原特异性信号,还需要CD28和4-1BB等分子介导的共刺激信号。增强第二信号可以降低T细胞活化时对第一信号的需求,即降低T细胞活化的阈值。一旦缺失第二信号,T细胞将出现反应无能从而导致病原逃避宿主的免疫防御。目前,靶向共刺激信号分子如CTLA-4和PD-1的免疫治疗已取得重大突破。鉴于我国养猪业频繁遭受各种传染性疾病的侵袭,提高猪群的抗病能力无疑是一种快速而有效的解决手段。在本研究中,我们拟通过转基因技术高表达猪共刺激分子CD28和4-1BB来增强疫苗的免疫效果,从而提升猪群的抗病能力。基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑分别将目的基因CD28或4-1BB定点整合到猪胎儿成纤维细胞的Rosa26位点,获得2株CD28转基因细胞系和4株4-1BB转基因细胞系,利用体细胞核移植技术制备转基因猪,成功获得5头F0代CD28转基因猪和3头F0代4-1BB转基因猪。鉴定结果显示,CD28和4-1BB均定点整合到预期位点,且能稳定表达,二者的mRNA水平分别高于同窝阴性仔猪。此外,血常规及生化指标显示CD28或4-1BB转基因对仔猪的生理健康无副作用。为验证高表达CD28和4-1BB能否增强疫苗的免疫保护效果,本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒为模型,分别在疫苗免疫和攻毒后,检测T细胞介导的免疫应答水平。结果发现,CD28转基因猪T细胞活化水平明显升高,而4-1BB为诱导性表达,对维持T细胞的增殖发挥重要作用。免疫后28天,CD28转基因猪CD4 T细胞的比例(26.03 ± 1.28%)显著高于野生型猪(21.57 ± 0.91%,P=0.046),其病毒中和抗体水平为野生型猪的2倍。50倍剂量的疫苗毒株攻毒后10天,转基因猪的临床症状较轻。转基因猪中和抗体滴度仍维持较高水平,CD8T细胞分泌IFN-y能力显著增强,血清中的病毒载量显著降低(P=0.02)。而4-1BB转基因对PRRSV抗体水平无显著影响,但可以促进Th1型细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌。进一步CTL体外杀伤试验结果显示,4-1BB转基因显著增强CTL对PRRSV感染靶细胞的杀伤效应。为探究CD28转基因对宿主抗感染能力的影响,我们以弓形虫Toxoplasma gondii为病原模型,检测感染后T细胞介导的适应性免疫应答特征。结果发现,与野生型猪相比,CD28转基因猪抗弓形虫感染的适应性免疫应答无显著差异,但其肝脏、肌肉等组织中的载虫量明显降低。该结果表明,CD28转基因猪具有一定的抗弓形虫感染的能力,但其具体机制仍需进一步研究。综上,本研究获得了定点整合且能稳定表达一额外拷贝的CD28或4-1BB转基因猪,揭示了两种共刺激分子均可以促进T细胞的效应功能,提升疫苗免疫效果和宿主的抗感染能力,为我国抗病育种事业提供了广谱抗病基因和新的研究策略。
【图文】：

编码序列,标签,启动子,编码序列

实验室前期己成功获得ＣＤ２８和４－１ＢＢ两种启动子，并验证了其调控效率。逡逑我们以ＰＢＭＣｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增获得ＣＤ２８和４－１ＢＢ的编码序列，并融合Ｆｌａｇ标签，逡逑电泳检测目的片段大小。结果显示，ＣＤ２８／Ｆｌａｇ和４－ｌＢＢ／Ｆｌａｇ大小分别为６８４ｂｐ和７５０ｂｐ（如图２－３Ａ逡逑和Ｂ所示）。逡逑本研宄通过ｏｖｅｒｌａｐ邋ＰＣＲ方法分别将ＣＤ２８或４－１ＢＢ的启动子，，ＣＤ２８或４－１ＢＢ的ＣＤＳ序逡逑列（Ｃ端融合Ｆｌａｇ标签），ＣＤ２８或４－１ＢＢ的３’ＵＴＲ串连，分别得到ＣＤ２８或４－１ＢＢ表达框，并在逡逑两个表达框上下游引入酶切位点，上游为ＥｃｏＲＶ，下游为ＡｓｃＩ和Ｋｐｎｌ。逡逑经电泳检测，ＣＤ２８表达框大小为３．８邋ｋｂ，邋４－１ＢＢ表达框大小为４．４邋ｋｂ，均与预期相符（如图逡逑３０逡逑

序列,框构

利用已公布的猪０ＣＴ４调控序列，设计引物，以成纤维细胞系ＹＫＸ００１基因组ＤＮＡ为模板，逡逑扩增ＯＣＴ４启动子，同时在５’端引入ＬｏｘＰ序列和Ｋｐｎｌ酶切位点。逡逑电泳检测目的片段大小接近３．４邋ｋｂ，与预期相符（如图２－４Ａ所示）。回收ＰＣＲ产物，连Ｔ载逡逑体。小提质粒，利用Ｋｐｎｌ、Ｎｄｅｌ和ＲｓｒＩＩ三种内切酶进行酶切鉴定，条带大小与预期相符，测序逡逑正确（如图２－４Ｂ所示）。逡逑３１逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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