猪链球菌2型PrlP转录调节因子调控毒力机制的研究

发布时间：2020-05-21 12:24

【摘要】：猪链球菌2型(SS2)作为重要的人兽共患病原菌,可造成脑膜炎、关节炎、败血症及中毒样休克综合征(STSLS)等,不仅在世界范围内造成了养猪业的重大损失,还严重威胁人类健康。截至目前SS2的致病机制仍未完全阐明。实验室前期通过转座子突变体库筛选到一个潜在的毒力相关因子PrlP,分析发现其属于XRE家族转录调节因子。研究其对SS2毒力的影响,并系统解析其机制,对进一步揭示SS2致病机制具有重要意义。为确定PrlP对SS2毒力的影响,本研究以SS2 SC19株为亲本株,构建了prl P基因缺失菌株Δprl P和回补菌株CΔprl P,对它们的生物学特性进行研究,发现prl P基因缺失菌株Δprl P于体外培养条件下链长显著变长。小鼠感染实验结果表明,prl P基因缺失后,感染小鼠的致死率显著下降、临床症状显著减轻;同时在小鼠体内定植能力、诱导炎症因子水平和组织损伤能力均显著下降,而回补该基因后这些性状回复或部分回复;说明prl P基因为SS2的重要毒力相关基因。由于XRE家族转录调节因子N-端结构域相对保守(HTH型特异性DNA结合结构域)、C端结构域高度可变的结构特点,为进一步探究影响SS2毒力的PrlP关键结构域,我们分别构建了PrlP N-端结构域及C-端结构域缺失突变株(ΔN(prl P)及ΔC(prl P)),并分析了它们的生物学特性和对小鼠的致病性。实验结果表明,PrlP C-端结构域缺失菌株ΔC(prl P)的生物学特性与致病性与野生株没有显著差别;而PrlP N-端结构域缺失菌株ΔN(prl P)的生物学特性和对小鼠致病性与PrlP缺失菌株Δprl P基本一致:PrlP N-端结构域缺失后,感染小鼠的致死率显著下降、临床症状显著减轻;同时在小鼠体内定植能力、诱导炎症因子水平和组织损伤能力均显著下降,而在Δprl P中回补该结构域的菌株CΔN(prl P)可以回复或部分回复这些表型。此外,体外吞噬实验表明,PrlP或其N-端结构域缺失后,SS2抗吞噬能力下降。以上结果表明,N-端结构域是PrlP调节SS2致病力的主要结构域。为了解析PrlP调控SS2毒力的机制,本研究通过RNAseq系统解析PrlP及其N-端结构域调控SS2基因表达情况。实验结果表明,相比野生株,PrlP缺失株及其N-端结构域缺失株有大量相同的差异表达基因。其中包括与营养物质转运和代谢、细胞生长与分裂、细胞壁/膜/胞膜合成、DNA复制重组与修复、蛋白质翻译后修饰、信号转导及防御机制等多种生命活动相关的基因。上述差异表达基因中,毒力相关基因Cia RH、Stk/Stp、ssp A-1、hp1330、fur等表达量显著下调;而细胞分裂相关基因mre C、mre D、stk等基因表达量发生显著上调或下调。提示PrlP或其N-端结构域可能通过调节上述基因表达进而调节SS2毒力和链长。综上所述,PrlP为猪链球菌2型重要全局性转录调节因子,其可通过调控SS2多种基因表达进而调控SS2毒力及其他表型,并且这种调控作用主要由其N-端结构域(HTH型特异性DNA结合结构域)实现。后续利用Ch IPseq等对PrlP直接/间接结合毒力基因的进一步研究将为深入解析SS2毒力调控网络奠定基础。
【图文】：

氨基酸,蛋白,网站,转录调节因子

在 SS2 SC84 株的全基因组序列中，PrlP 编码基因为 SSUSC84_0951，共 801 个碱基，编码 266 个氨基酸，位于染色体正链（如图 4-1）。通过将 prlP 基因序列在NCBI 网站上进行 BlastP 比对，发现该基因在 S.suis 中广泛存在并高度保守。将 PrlP 氨基酸序列在 Interpro 数据库和 NCBI 网站 Conserved domains 数据库进行比对分析发现，该蛋白 N 端（1-74 氨基酸）为 HTH 型 XRE 超家族蛋白结构域，包含有多个特异性 DNA 结合位点（如图 4-2；）该蛋白 C 端（146-263 氨基酸）为功能未知的肽酶结构域。推测该蛋白为 XRE 家族转录调节因子。图 4-1 SS2 中 prlP 基因座的示意图Fig. 4-1 Schematic representation of the prlP locus in SS2

重组质粒,酶切鉴定,菌株,壮观霉素

图 4-3 重组质粒的酶切鉴定ntification of recombinant plasmids by enzrker；1、2：BamH I:/Pst I 双酶切重组质粒失突变株的筛选与鉴定4s-ΔprlP 电转入 SS2 野生株 SC19 后，筛选对壮观霉素敏感的双交换菌株。ΔprlP-L-1、ΔprlP-R-2）对其进行 P次扩增，，并送样测序，确保菌株发生止密码子 TGA，完全缺失 prlP 基因 8
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】