乳酸杆菌表面蛋白GAPDH粘附粘液素介导肠道定植的研究

发布时间：2020-05-21 15:01

【摘要】：乳酸杆菌作为一种益生菌在动物肠道中发挥重要的益生效应。其粘附特性是益生菌在肠道内成功定植发挥益生性的基础,并且成为筛选高效益生菌的重要标准之一。乳酸杆菌表面蛋白三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)在细胞表面发挥粘附肠道表层粘液素的作用。但是GAPDH由胞浆分泌到细胞表面的跨膜分泌规律和菌体表面的分布特征尚不明确,阐明GAPDH发挥对猪肠道粘液素的粘附作用,对于筛选和培育高效乳酸菌有重要意义。本试验旨在以具有高粘附性的乳酸杆菌ZJ617和低粘附性乳酸杆菌ZJ615为代表,研究表面蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)在乳酸杆菌不同生长期的分泌特性及其粘附粘液素参与肠道粘附作用。低黏附ZJ615和高黏附ZJ617罗伊氏乳酸杆菌培养不同时间(3、6、9、12、15、18 h),以氯化锂提取表面蛋白,免疫印迹(Western blotting)定量表面蛋白GAPDH含量;二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)双染色法结合流式细胞仪检测细胞膜通透性;利用免疫电镜定位不同生长时期乳酸杆菌表面蛋白GAPDH;两种菌培养至18h(平台期)与载玻片固定猪肠道粘液素共同孵育1h,分析抗体封闭表面蛋白GAPDH、高碘酸氧化粘液素或抗体封闭加氧化双重处理后,革兰氏染色分析乳酸杆菌粘附数量;分子互作仪ForteBio分析不同处理条件下乳酸杆菌与粘液素的动力学结合特征。研究结果表明:1)乳酸杆菌表面蛋白GAPDH含量在6h(对数生长期)最高(P0.05),进入生长后期(12h、15h、18h)后含量显著下降(P0.05);高黏附乳酸杆菌ZJ617不同培养时间的GAPDH蛋白含量均高于ZJ615(P0.05)。2)乳酸杆菌培养至对数生长期(6h)细胞膜通透性最高(P0.05),生长后期(12h、15h、18h)通透性降低(P0.05);高粘附乳酸杆菌ZJ617不同时间细胞膜通透性均高于ZJ615(P0.05)。ZJ617和ZJ615不同培养时间表面蛋白GAPDH分泌量和细胞膜通透性相关性分别为0.8和0.6。3)与载玻片固定有粘液素时,乳酸杆菌的粘附数量相比,无粘液素固定、抗体封闭GAPDH、高碘酸氧化粘液素后乳酸杆菌粘附数量显著降低(P0.05);抗体封闭和高碘酸氧化双重处理,乳酸杆菌粘附数量进一步显著降低(P0.05);上述各处理下,高粘附乳酸杆菌ZJ617粘附数量显著高于低黏附ZJ615(P0.05)。动力学相互作用结果显示,与对照组相比,各处理组:高碘酸氧化、去蛋白、加热和抗体封闭之后,各组反应值均减弱。由此可见,对数生长期乳酸杆菌表面蛋白GAPDH含量最高,其分泌与细胞膜通透性成正相关;高黏附乳酸杆菌具有表面蛋白GAPDH,通过粘附肠道粘液素在乳酸杆菌肠道定植中发挥作用。
【图文】：

长比例法检测[52]。通过荧光探针法可以快速方便的检测出细胞中离子差异，从而得到细胞膜通透性的变化。1.2.2.3 流式细胞仪检测流式细胞仪可以快速准确的定量多个细胞的状态，结合荧光探针二乙酸荧光素（fluorescein diacetate, FDA）和碘化丙啶（propidium iodide, PI）标记特异性，分析细胞膜通透性[53-54]。FDA 只能与具有完整细胞膜结构的细胞结合，本身不带电荷的脂质性分子、 不发荧光，但通过自由扩散进入细胞后可被酶水解为荧光素，由于其极性而留存于细胞中，若细胞通透性增加，FDA 流出细胞外，细胞无法发出荧光。然而与 FDA 不同的是，当细胞膜通透性增加时，PI 可以通过细胞膜并且与核酸作用发红色荧光[55]。有研究通过激光诱导冲击波，导致细胞产生可修复性损伤，提高细胞膜通透性，采用 FDA 和 PI 双染色检测法运用流式细胞仪检测了细胞膜通透性的变化[56]。作者所在课题组利用 FDA 和 PI 双染色法检测不同时间乳酸杆菌细胞膜通透性，通过流式细胞仪检测所获得的点状图表现出一定的差异。被 FDA 染色的细胞会落在 Q3 象限，，被 PI 染色的细胞会显示在 Q1 象限，说明不同培养时间乳酸杆菌细胞膜通透性是不同的（图 1）。

6×109CFU/ml。表 2.1 不同培养时间乳酸杆菌菌数统计（CFU/ml）Table2.1Statistics of lactobacillus bacteria at different culture time培养时间（h） 3 6 9 12 15 18ZJ615 6.3×1071.6×1085×1083×1086.2×1098×109ZJ617 1.3×1075.3×1072.0×1086×1089.2×1081.2×109乳酸杆菌 ZJ615 和 ZJ617 分别厌氧培养不同时间，将不同时间乳酸杆菌菌数调整约 6×109CFU/ml。离心后菌体经过氯化锂提取表面蛋白，western blot 定位不同时间表面蛋白 GAPDH 的含量，研究结果显示：乳酸杆菌表面蛋白 GAPDH 含量在 6h（对数生长期）最高（P＜0.05），进入生长后期（12h、15h、18h）后含量显著下降（P＜0.05）；高黏附乳酸杆菌 ZJ617 不同培养时间的 GAPDH 蛋白含量均高于 ZJ615（P＜0.05）（图 2.1）。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.6

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本文编号：2674476