【摘要】：旋毛虫病由旋毛虫引起,是一种人兽共患病,严重威胁人类的健康,在世界范围内广泛流行。感染者由于食入含有感染性包囊的生的或者未加工完全的肉类食品而感染,具有较高的感染率。人感染后临床表现主要为发热,呼吸困难,腹泻,水肿等,对人类健康产生很大威胁。旋毛虫排泄分泌抗原(ES抗原),主要由虫体排泄分泌产生,由于旋毛虫成虫体外培养存活时间短,所以目前应用于研究的ES抗原主要来自肌幼虫时期。ES抗原能够诱导宿主产生免疫反应,因此现阶段被频繁用于旋毛虫病的诊断、疫苗以及免疫等方面。丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)是一类蛋白质超家族,研究证实,在生物体凝血、补体活化等多个生理反应中均有丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在,起到至关重要的作用。旋毛虫SPI是旋毛虫ES抗原中为数不多的特异性抗原之一,在免疫预防和诊断方面作用重大,所以,本研究选择旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂和旋毛虫肌幼虫ES抗原进行旋毛虫感染方法的建立。本研究中选用纯化后的旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂以及旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,同时对条件进行一系列的优化。最终确定抗原的最佳包被量TsAdSPI为0.09375μg/孔,旋毛虫肌幼虫ES抗原为1.5μg/孔;最佳血清稀释比例TsAdSPI为1:400,旋毛虫肌幼虫ES抗原为1:100;二抗最佳稀释比例TsAdSPI为1:6000,旋毛虫肌幼虫ES抗原为1:5000;敏感度TsAdSPI为1:12800,旋毛虫肌幼虫ES抗原为1:6400;宿主敏感性试验中TsAdSPI最早在感染20条旋毛虫感染14 d时检测为阳性,ES抗原最早在感染20条旋毛虫感染21 d时检测为阳性;在特异性试验中,本研究选用日本血吸虫和华支睾吸虫,试验结果显示均未出现交叉反应;选用生产批号不同的酶标板进行批间和批内的重复试验,结果显示两种重复试验的变异系数均小于10%。临床检测80份样品,TsAdSPI阳性检出率为36.25%(29/80),ES抗原为26.25%(21/80),试验结果证明TsAdSPI敏感性高于ES抗原。利用纯化后的TsAdSPI和旋毛虫肌幼虫ES抗原进行包被,以NC膜作为固相载体建立Dot-ELISA检测,同时对条件进行一系列的优化。最终确定最佳抗原包被量TsAdSPI为0.25μg/片,ES抗原为2μg/片;最佳血清稀释比例分别为1:400和1:200;最佳二抗稀释比例分别为1:8000,和1:6000;敏感性TsAdSPI可达到1:12800,旋毛虫肌幼虫ES抗原可达到1:6400;宿主敏感性试验中TsAdSPI最早在感染50条旋毛虫感染14 d时检测为阳性,ES抗原最早在感染100条旋毛虫感染14 d时检测为阳性;对3个批次的膜片进行重复性试验,两种蛋白重复性均理想;在特异性试验中,本研究选用日本血吸虫和华支睾吸虫,试验结果显示均未出现交叉反应。临床检测80份样本结果显示,TsAdSPI阳性检出率为26.25%(21/80),旋毛虫肌幼虫ES抗原阳性检出率为15%(12/80),试验结果证明旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂比P53更具有敏感性。利用TsAdSPI和P53基因为靶序列分别设计并合成引物,以不同感染天数不同感染旋毛虫条数的小鼠血液提取的DNA为模板,进行PCR检测,同时设阳性和阴性对照,旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的PCR反应程序为95℃变性10 min,95℃30 s、56.7℃30 s、72℃1min,72℃10 min共30-35个循环。P53反应程序为95℃变性10 min,95℃30 s、52.9℃30s、72℃74 s,72℃10 min共30-35个循环。结束后对PCR产物进行鉴定,结果显示利用旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂为引物最早在感染8条旋毛虫感染24 h时扩增出目的条带,感染7 d后所有试验样本均扩增出特异性条带;而以P53为引物进行PCR检测,结果表明仅在感染旋毛虫超过50条且感染时间在14 d后才可扩增出目的条带。对80份临床样本进行检测,以TsAdSPI为引物阳性检出率为43.75(35/80)以P53为引物阳性检出率为13.75(11/80)试验表明旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂比P53更具有敏感性。
【图文】：
图 3-1 抗原最佳包被量确定Fig. 3-1 The optimum amount of antigen is determined当 TsAdSPI 蛋白包被量为 0.25 μg/片时膜片中央斑点显色较为均匀和明显，因此确g/片为最佳包被量。.2 最佳封闭液的确定
封闭液的确定Fig.3-2Blockingfluiddetermination
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.9
【参考文献】
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