秦川牛Smad2和Smad3基因转录调控研究

发布时间：2020-05-22 13:03

【摘要】：TGF-β信号通路是参与肌肉和脂肪生长发育调控的重要信号通路之一,而且是肌细胞和脂肪细胞分化的强抑制剂。Smads蛋白家族在TGF-β信号通路中起到至关重要的作用,它们能将信号由细胞膜转至细胞核中从而调节靶基因的转录。而Smad2/Smad3是由激活素TGF-β激活的R-Smads。研究证实在TGF-β1抑制成肌和成脂分化过程中起到关键作用的是Smad3基因而不是Smad2基因。鉴于Smad3可能存在的抑制成肌细胞和前体脂肪细胞分化的潜在作用,本研究通过腺病毒介导Smad3基因过表达和沉默的方法,探讨Smad3在调控牛成肌细胞和前体脂肪细胞分化过程中的作用。同时,虽然Smad2和Smad3的氨基酸相似性高,但其结构、功能和转录调控都存在显著的差异,本实验从细胞转录水平上对牛Smad2和Smad3基因的转录调控机制及相互之间的调控关系进行了初步的研究。主要研究结果如下:(1)成功克隆了秦川牛Smad3基因CDS区序列,全长为1278bp,编码了425个氨基酸残基,并筛选得到一条靶向Smad3基因干扰效率高达83.3%的sh RNA序列。构建了秦川牛Smad3基因的腺病毒穿梭载体p DC316-m CMV-EGFP-b SMAD3和p DC316-EGFP-Sh RNA-b SMAD3-1405,用这两种携带目的基因的重组质粒分别和骨架质粒共转染到HEK293A细胞中包装病毒,扩繁浓缩获得为高滴度病毒,用La SRT法测定病毒滴度,过表达腺病毒AD-b Smad3和AD-NC(空载病毒)的滴度均为1×10~（10）PFU/m L;干扰腺病毒AD-Sh RNA-b SMAD3,AD-Sh RNA-NC(空病毒)的腺病毒滴度也均为1×10~（10）PFU/m L。(2)在前体脂肪细胞中过表达Smad3基因,显著抑制了成脂标志基因PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表达,相反干扰沉默Smad3基因后,促进了PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表达。油红O染色发现在前体脂肪细胞过表达Smad3基因,抑制细胞中脂滴的积累,干扰沉默Smad3基因后,前体脂肪细胞中脂滴的含量升高。因而证明Smad3基因能够显著地抑制秦川牛前体脂肪细胞的分化。同样,在成肌细胞中过表达Smad3基因,显著抑制了肌细胞分化标志基因Myo D和Myo G的表达,而干扰沉默Smad3基因后,促进了Myo D和Myo G的表达。细胞形态观察发现干扰Smad3基因后,肌管变长变多。(3)克隆得到Smad3基因5'侧翼序列1143bp,其核心启动子区位于-337~-41bp之间。通过定点突变转录因子结合位点,确定了KLF6、KLF15、KLF7和MZF1在维持Smad3基因启动子活性中的作用;体外EMSA实验进一步证实KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是Smad3基因的关键转录因子。转染KLF6-si RNA、KLF15-si RNA、KLF7-si RNA、MZF1-si RNA以及对照Control si RNA到前体牛脂肪细胞和成肌细胞中,采用Real-time PCR方法检测发现,KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是维持牛Smad3基因启动子基本转录活性必需的顺式作用元件。(4)采用Real-time PCR方法检测发现,Smad2和Smad3基因在牛的各个组织中广泛表达,氨基酸相似性高达89.2%。在成肌细胞分化过程中,Smad2和Smad3基因表达趋势相同,随着肌管形成其表达量显著增加。但是Smad3对Smad2基因的转录表达是抑制作用,无论是牛成肌细胞处于高血清生长培养基(GM:F12/DMEM+20%FBS)还是低血清培养基分化培养基(DM:F12/DMEM+2%HS)。(5)采用5’末端c DNA快速扩增法(SMART RACE c DNA Amplification),确定牛Smad2基因存在的的转录起始位点,与已报道Smad2基因的mRNA序列(NM_001046218)转录起始位点相比,我们将Smad2基因m RNA序列的5'UTR在原有基础上向前推进5 bp。克隆得到牛Smad2基因5'侧翼序列1243 bp,而其核心启动子区域位于-158~-35bp。通过定点突变转录因子结合位点,确定了C/EBPα和C/EBPβ结合在Smad2基因核心启动子区域。体外EMSA实验进一步证实C/EBPα和C/EBPβ转录因子能够结合在牛Smad2基因的核心启动子区域。(6)细胞培养基的不同会影响C/EBPα和C/EBPβ转录因子、Smad2和Smad3基因的调控。在低血清的分化培养基条件下的牛成肌细胞中C/EBPα和C/EBPβ抑制Smad2基因的表达,Smad3基因促进C/EBPα和C/EBPβ基因的表达;而在高血清生长培养基条件下的牛成肌细胞中,C/EBPα和C/EBPβ转录因子促进Smad2基因的表达,Smad3基因抑制C/EBPα和C/EBPβ基因的表达。Smad3基因调控Smad2基因的表达可能是通过调控其关键转录因子C/EBPα和C/EBPβ的表达。综上所述:本文应用腺病毒介导的基因过表达与干扰沉默技术,探讨了Smad3基因在调控秦川牛前体脂肪细胞与成肌细胞分化过程中的作用,以及对一些在肌肉生长发育和脂质代谢过程中发挥重要作用的功能基因转录水平的影响;也探讨了Smad2和Smad3基因之间在转录水平上的调控机制,为进一步研究TGF-β信号通路在秦川牛肌肉和脂肪的形成过程中的调控机制提供一定的理论依据,也为下一步的中国肉牛育种工作奠定基础。
【图文】：

从而下调了 PPAR γ 的表达(Alves et al. 2017; Choy et al. 2000)。鉴于 Smad3 可能存在的抑制牛成肌细胞和前体脂肪细胞分化的潜在作用，我们通过腺病毒介导 Smad3 基因在秦川牛前体脂肪细胞和成肌细胞中过表达和沉默，再应用油红 O 染色、实时荧光定量PCR 等技术，探讨 Smad3 在调控牛成肌细胞和前体脂肪细胞分化过程中的作用机制。近期有研究表明在小鼠上，虽然Smad2和Smad3的氨基酸相似性高达92%，对TGFβ信号通路来说同等重要，，但是二者在细胞内的比例却会影响 TGFβ 抑制细胞生长作用(Kim et al. 2005)。因而我们提出假设是否存在一种因子能够调控两种信号通路之间的平衡。本实验通过克隆 Smad2 和 Smad3 基因启动子序列，双报告系统检测核心启动子序列，定点突变，EMSA 方法鉴定其关键转录因子；在转录水平上初步探索目标基因 Smad2与 Smad3 之间的调控关系。本研究可为探明 Smad2 和 Smad3 基因在调控大型家畜（牛）肌细胞和脂肪细胞分化的作用机制提供理论依据，为进一步研究牛 TGFβ 信号通路在秦川牛骨骼肌和脂肪的生长发育过程中的调控机制的研究奠定一定的理论基础。1.2 成肌细胞分化研究进展1.2.1 成肌细胞分化的起源

1.3 脂肪细胞分化研究进展1.3.1 脂肪细胞分化的起源许多研究已经证明脂肪细胞是由中胚层的多能干细胞发育分化而来的。根据在脂肪细胞的分化过程中脂滴发生的变化一般可将脂肪细胞分为，脂肪母细胞、脂肪前体细胞、前脂肪细胞和成熟的脂肪细胞(Aggarwal et al. 2005; Rodriguez et al. 2004)。脂肪组织的增长是脂肪细胞数量的增加以及体积增大的结果。前体脂肪细胞是脂肪组织基本的生物学单位，其增殖分化能力的持续存在伴随着动物的一生(Rodriguez et al. 2004)。前体脂肪细胞还是一种新发现的多能干细胞。近年来前体脂肪细胞不仅是可以用于研究动物脂肪组织的发育形成以及分泌脂肪细胞因子等过程， 也可以作为细胞模型用来在体外研究动物脂肪组织的生脂过程以及其代谢调控的分子机制。因而对前体脂肪细胞的研究不仅对改善动物的胴体品质、改良动物品种和提高人们的生活水平上有着重要意义， 而且在研究人类的糖尿病、肥胖症、相关的代谢疾病以及组织移植等方面都有着较为广泛的应用前景(Poulos et al. 2016)。但是，前体脂肪细胞增殖、分化和发育形成脂肪组织过程中确切的调控机制还有待进一步的深入研究。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

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本文编号：2676037