狂犬病病毒入胞方式初步研究

发布时间：2020-05-24 06:18

【摘要】：狂犬病病毒(RABV)是具神经嗜性的高度致死性人兽共患传染性病原,感染机体可引起神经性脑脊髓炎,临床表现出恐水、怕风、肌肉痉挛等症状,死亡率高达100%。RABV病毒粒子由5种结构蛋白组成,分别为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)、基质蛋白(M)和依赖RNA的RNA多聚酶(L);其中N、P、L组成核糖核蛋白复合体(RNP),在RABV复制及转录过程中起着非常关键的作用;G负责识别细胞膜上受体并介导病毒的胞内运输过程,在RABV入胞过程中的作用十分重要。细胞内吞是通过细胞质膜的变形运动将细胞外物质转运入细胞内的过程。不仅蛋白质、多糖等大分子物质借用此过程进入细胞,许多有囊膜病毒也通过内吞方式进入细胞,实现其对宿主的感染。网格蛋白是最为常见的一种内吞标志蛋白,其介导多数大分子物质的入胞过程;小窝/脂筏介导的内吞途径在物质入胞过程中同样起重要作用,其中小窝蛋白1是小窝的标志性蛋白,而胆固醇在维持小窝的结构稳定性作用中十分关键,因此细胞中小窝蛋白1表达量和胆固醇含量是衡量小窝功能的一个重要标志。本研究首先利用蛋白酶k处理的方法,选取接毒孵育的不同时间点加入蛋白酶k并收集细胞,确定RABV感染N2a细胞的入胞时间;随后以网格蛋白和小窝依赖性内吞方式为出发点,在N2a细胞中,加入网格蛋白特异性抑制剂氯丙嗪、胆固醇抽提剂制霉菌素和甲基-β-环糊精(MβCD)、发动蛋白特异性抑制剂dynasore和囊泡酸化特异性抑制剂巴佛洛霉素a1处理细胞后感染RABV。采用RT-q PCR及western blot方法检测RABV N的表达量;通过免疫荧光方法观察药物处理后RABV在N2a细胞中的感染率;随后采用基因沉默手段下调N2a细胞中网格蛋白重链及小窝蛋白1的表达水平,并采用RT-q PCR和western blot方法检测RABV N基因拷贝数和N蛋白表达水平。为验证RABV在不同细胞系中的入胞途径,本研究还在SH-SY5Y和Vero细胞中加入上述抑制剂后感染RABV,采用RT-q PCR方法检测RABV N基因拷贝数。结果显示,在2h时大约95%病毒粒子进入细胞。随后观察到,经氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1处理的N2a细胞感染RABV后,随药物浓度增大,与对照组相比,细胞中RABV N基因拷贝数及N蛋白的表达水平均呈剂量依赖性下降趋势;免疫荧光检测结果显示,药物处理后,N蛋白荧光数量与对照组相比显著减少。然而制霉菌素和MβCD处理N2a细胞后,细胞中RABV N基因拷贝数和N蛋白表达量与对照组相比无显著差异。随后下调网格蛋白重链的表达后,RABV N基因拷贝数和N蛋白表达水平与对照组相比均显著降低,而下调小窝蛋白1的表达后,RABV N基因拷贝数和N蛋白表达量与对照组相比均无显著差异。在SH-SY5Y和Vero细胞中加入氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1后RABV N基因拷贝数与对照组相比也显著下降,而加入制霉菌素后RABV N基因拷贝数与对照组相比无显著差异,此结果与N2a细胞中的检测结果一致。以上结果表明,RABV需要约2小时完成对N2a细胞的感染。且RABV进入N2a细胞不依赖于小窝内吞途径,而依赖于网格蛋白介导、发动蛋白剪切作用和内吞体的酸化作用,而在SY5Y和Vero细胞中初步验证结果与N2a细胞中一致,表明RABV进入不同细胞系的入胞途径可能相一致。本研究结果为进一步研究狂犬病病毒感染不同细胞系的相应机制和针对RABV入胞的药物靶点研究提供了新的数据。
【图文】：

病毒,途径,细胞

第一篇文献综述第二章病毒入胞机制研究进展泡与胞膜脱离机制的体外研究已十分清晰，但其在体内发挥作用是如何被调控以及它在体内真正的作用机理目前仍然没有明确结论[50-52]，仍有待进一步研究。多数病毒利用一种或多种细胞内吞途径进入细胞，病毒通过内吞作用进入细胞可以使其逃避细胞膜对外来入侵物质的阻隔作用而顺利到达细胞质中。大多数依赖内吞入胞的病毒利用了上百种胞质蛋白进入细胞，随后由膜泡运输系统转运至各个细胞器。如图 2.1[4]所示，病毒可以利用多种内吞机制来促使自身进入细胞，其中网格蛋白介导的内吞方式被多数病毒所利用。

复合体结构,小窝

2.2 小窝蛋白介导的病毒内吞机制由小窝/脂筏介导的内吞方式的一个典型标志，是早期内吞体的形成依赖于胆固醇、脂筏和一系列包含酪氨酸激酶、磷酸酶的复杂信号通路[64]，，此过程由配体触发，是细胞内吞途径中的一个重要过程。组成小窝的小窝相关蛋白在细胞内组成复合体，它们在体外可以进行相互作用并与细胞进行免疫共沉淀反应[65, 66]；利用蔗糖密度梯度离心的方法可以将组成小窝蛋白复合体的相关蛋白彼此分离[67]，最近 LudwigA 等[68]研究发现，Hela 细胞中表达的组成小窝的相关蛋白通过分离可以得到一个 80S 复合体，如图 2.2 所示，此复合体的分子组成可以表示为12 个 caveolin：3 个 cavin 1：1 个 cavin 2 或 cavin 3。其中 cavin 1 参与核糖体RNA 的合成过程，并且在细胞核内参与基因的复制及转录过程[69]；而小窝蛋白1（caveolin-1）则在细菌中可以独立完成细胞膜囊泡的形成[70]，参与许多重要生理过程。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】