Rapamycin对水牛成纤维细胞周期同期化以及核移植效率的影响
发布时间：2020-05-25 05:57
【摘要】：体细胞核移植技术尽管在许多哺乳动物已获得了成功,但克隆效率偏低仍然制约着该技术的应用。供体细胞周期调控是提高核移植效率的重要途径之一,因供体和受体细胞的细胞周期协调与克隆效率关系非常密切。Rapamycin是一种mTOR(mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白特异性抑制剂,能阻断细胞由G1至S期的进程,将细胞周期静止在G1期。因此,本研究探讨了Rapamycin和血清饥饿对BEF细胞周期和体细胞核移植胚胎发育能力的影响,旨在寻找一种合适的供体细胞同期化方法,为提高水牛体细胞克隆效率提供理论和技术依据。首先,比较了不同浓度Rapamycin(0,0.5,1,2,4μM)处理对BEF细胞周期和活力的影响。结果发现,11μM Rapamycin处理组细胞的活力及G0/G1期的比例显著高于对照组和其他试验组(P0.05)。比较Rapamycin处理BEF不同时间(0、48、72、96 h)对细胞周期的影响结果显示:1μM Rapamycin处理BEF 72 h和96 h细胞G0/G1期比例显著高于其他组(P0.05)。其次,比较了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF细胞周期的影响。结果发现,Rapamycin同期化效率显著高于血清饥饿法(P0.05);qPCR结果显示,Rapamycin和血清饥饿处理均能显著下调CyclinD1、Cyclin基因的表达(P0.05),上调p27的表达水平(P0.05),但是Rapamycin组p27的表达水平显著高于血清饥饿组(P0.05);而且Rapamycin还显著下调了CDK2 的表达(P0.05);Western blot结果显示,Rapamycin和血清饥饿都增加了p27蛋白的表达水平(P0.05),降低了CyclinDl蛋白表达(P0.05),但是Rapamycin也显著抑制了mTOR蛋白的磷酸化水平(P0.05)。接着,探究了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF生理特征的影响。Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡结果发现:血清饥饿组凋亡水平显著高于Rapamycin组(P0.05);qPCR结果显示,Rapamycin显著上调了抑凋亡基因Bcl-2的表达水平(P0.05),显著下调了促凋亡基因Casepase3、Casepase9的表达(P0.05),而血清饥饿组显著上调了促凋亡基因Bad的表达水平(P0.05);细胞活性氧检测发现,与Rapamycin处理组相比,血清饥饿处理显著增加了细胞ROS水平(P0.05);对BEF细胞代谢相关基因表达的检测发现,Rapamycin处理组显著上调了代谢相关基因ACADVL、Ass、HMGCL的表达水平(P0.05)。此外,BEF经Rapamycin处理后细胞具有正常染色体倍数的细胞比例显著高于血清饥饿组(P0.05)。最后,比较了Rapamycin和血清饥饿处理BEF对其核移植后胚胎发育能力的影响。结果发现,BEF经Rapamycin处理用作供体细胞进行核移植,核移植胚胎的8细胞率和囊胚率显著高于血清饥饿组和对照组(P0.05)。以上结果表明,(1)适宜浓度(1μM)的Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞一定时间(72 h)能够提高细胞活力和G0/G1期的比例。(2)Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后G0/G1期的比例显著高于血清饥饿法,这一作用可能是因为Rapamycin通过抑制mTOR磷酸化水平影响了细胞周期相关基因的表达所致。(3)Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后凋亡水平显著低于血清饥饿组,推测可能和Rapamycin降低细胞ROS水平、调控体内代谢有关。(4)Rapamycin显著提高了核移植胚胎发育能力,这一作用可能与Rapamycin提高BEF G0/G1期比例和细胞活力有关。
【图文】：
分别使用不同浓度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋（０，邋０．５，邋１，邋２，邋４邋ｈＭ）处理ＢＥＦ邋３ｄ并使用ＣＣＫ－８逡逑对细胞活力进行检测，0．５｜ｉＭ，ｌｐｉＭ，２ｊ＿ｉＭ，４ｐＭ浓度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理组为试验组，０逡逑ｐＭ处理组为对照组。结果如图１－１所示，在ＢＥＦ培养过程中添加Ｒａｐａｍｙｃｉｎ能够提高细逡逑胞的活力水平，并且细胞活力随着处理浓度的增加呈现先升高而后降低的趋势，其中ＵｉＭ逡逑和２邋｜＿ｉＭ的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理细胞时细胞活力最高，显著高于对照组和其他试验组（尸＜邋０．０５）。逡逑３１逡逑
本试验以Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理法（１０％ＦＢＳ＋１Ｒ）和血清饥饿法（０．５％ＦＢＳ）分别处理ＢＥＦ逡逑３ｄ为试验组，以标准培养基（Ｉ０％ＦＢＳ）培养ＢＥＦ邋３ｄ作为对照组，，收集各组细胞，进行逡逑细胞核型分析，选取染色清晰的染色体进行拍照（如图１－１０）并进行统计，结果如表１－１２逡逑所示，Ｒａｐａｍｙｃｉｎ组细胞具有正常染色体倍数的细胞比例显著高于血清饥饿组（Ｐ邋＜邋０．０５邋）。逡逑表１－１２邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ对ＢＥＦ细胞核型的影响逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋ｏｎ邋ＢＥＦ邋ｃｅｌｌ邋Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ逡逑ＢＥＦ逦整二倍体个数（２ｎ）逦非整二倍体个数（＃２ｎ）￣整二倍体细胞比率（％）逡逑Ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ邋Ｎｏｎ－ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ逦Ｎｏｒｍａｌ邋ｒａｔｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦３５逦１２逦７４．４７邋土邋０．７７ａ逡逑Ｒａｐａｍｙｃｉｎ逦３２逦１０逦７６．１９邋±０．４３ａ逡逑Ｓｅｒｕｍ邋ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ逦３０逦１６逦６５．２２邋土邋０．１２ｂ逡逑注：Ｍ列同字付丨？．标的饥代农范异Ｖp海ǎ校迹埃埃担╁义希危铮簦澹哄澹模椋妫裕澹颍澹睿翦澹欤澹簦簦澹颍箦澹椋铄澹簦瑁邋澹螅幔恚邋澹悖铮欤酰恚铄澹椋睿洌椋悖幔簦邋澹螅椋纾睿椋妫椋悖幔睿翦澹洌椋妫妫澹颍澹睿悖澹螅澹椋绣澹煎澹埃埃靛澹╁义希常瑰义
本文编号：2679677
【图文】：
分别使用不同浓度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋（０，邋０．５，邋１，邋２，邋４邋ｈＭ）处理ＢＥＦ邋３ｄ并使用ＣＣＫ－８逡逑对细胞活力进行检测，0．５｜ｉＭ，ｌｐｉＭ，２ｊ＿ｉＭ，４ｐＭ浓度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理组为试验组，０逡逑ｐＭ处理组为对照组。结果如图１－１所示，在ＢＥＦ培养过程中添加Ｒａｐａｍｙｃｉｎ能够提高细逡逑胞的活力水平，并且细胞活力随着处理浓度的增加呈现先升高而后降低的趋势，其中ＵｉＭ逡逑和２邋｜＿ｉＭ的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理细胞时细胞活力最高，显著高于对照组和其他试验组（尸＜邋０．０５）。逡逑３１逡逑
本试验以Ｒａｐａｍｙｃｉｎ处理法（１０％ＦＢＳ＋１Ｒ）和血清饥饿法（０．５％ＦＢＳ）分别处理ＢＥＦ逡逑３ｄ为试验组，以标准培养基（Ｉ０％ＦＢＳ）培养ＢＥＦ邋３ｄ作为对照组，，收集各组细胞，进行逡逑细胞核型分析，选取染色清晰的染色体进行拍照（如图１－１０）并进行统计，结果如表１－１２逡逑所示，Ｒａｐａｍｙｃｉｎ组细胞具有正常染色体倍数的细胞比例显著高于血清饥饿组（Ｐ邋＜邋０．０５邋）。逡逑表１－１２邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ对ＢＥＦ细胞核型的影响逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋ｏｎ邋ＢＥＦ邋ｃｅｌｌ邋Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ逡逑ＢＥＦ逦整二倍体个数（２ｎ）逦非整二倍体个数（＃２ｎ）￣整二倍体细胞比率（％）逡逑Ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ邋Ｎｏｎ－ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ逦Ｎｏｒｍａｌ邋ｒａｔｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦３５逦１２逦７４．４７邋土邋０．７７ａ逡逑Ｒａｐａｍｙｃｉｎ逦３２逦１０逦７６．１９邋±０．４３ａ逡逑Ｓｅｒｕｍ邋ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ逦３０逦１６逦６５．２２邋土邋０．１２ｂ逡逑注：Ｍ列同字付丨？．标的饥代农范异Ｖp海ǎ校迹埃埃担╁义希危铮簦澹哄澹模椋妫裕澹颍澹睿翦澹欤澹簦簦澹颍箦澹椋铄澹簦瑁邋澹螅幔恚邋澹悖铮欤酰恚铄澹椋睿洌椋悖幔簦邋澹螅椋纾睿椋妫椋悖幔睿翦澹洌椋妫妫澹颍澹睿悖澹螅澹椋绣澹煎澹埃埃靛澹╁义希常瑰义
本文编号：2679677
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2679677.html
