牛IRF3和IRF7启动子活性分析
发布时间：2020-05-25 09:17
【摘要】：干扰素调节因子3(IRF3)和干扰素调节因子7(IRF7)是干扰素转录因子家族的成员,是抗病毒感染天然免疫应答的关键分子,主要参与炎症反应和免疫反应,诱导I型干扰素的产生。为了研究IRF3和IRF7在表达调控中的作用,本研究检测了IRF3和IRF7在犊牛组织中的分布情况,结果表明IRF3在犊牛脾脏中含量最高,在肝脏中含量最少,IRF7属于诱导型表达,在各个组织中的含量都很低。随后对IRF3和IRF7进行了克隆和表达,并制备了高效价的多克隆抗体,为后续实验提供了物质材料。为了探索IRF3和IRF7的转录调控机制,本实验以牛肝基因组为模板分别克隆了IRF3和IRF7启动子,并分别构建了IRF3和IRF7启动子双荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶基因报告系统检测IRF3和IRF7启动子的活性,随后构建了包含IRF3和IRF7启动子一系列5’侧翼区不同长度截短片段的双荧光素酶报告基因载体,结果表明IRF3基因上游-1511到-1012bp存在转录因子结合的正调控区域,-12至+40bp存在转录因子结合的负调控区域;IRF7基因上游-550到-311bp存在转录因子结合的正调控区域。生物信息学软件预测发现在IRF7基因上游-550到-311bp之间存在转录因子SP1和STAT1的结合位点。为了进一步探索转录因子SP1和STAT1对IRF7的影响,本研究克隆了转录因子SP1和STAT1,并构建了真核表达载体pCMV-HA-SP1和pCMV-HA-STAT1,与IRF7启动子共转染细胞,结果表明SP1和STAT1可增强IRF7启动子的活性,过表达SP1和STAT1能增强IRF7的蛋白表达水平。随后利用RNA干扰实验,构建了SP1和STAT1的干扰RNA pSH-SP1和pSH-STAT1,发现转染干扰RNA pSH-SP1和pSH-STAT1后可降低IRF7的启动子活性,同时也会抑制IRF7的蛋白表达水平。本研究证明了IRF3基因上游的-1511到-1012bp存在转录因子结合的正调控区域,-12至+40bp存在转录因子结合的负调控区域;IRF7基因上游的-550到-311bp之间存在转录因子结合的正调控区域,转录因子SP1和STAT1在IRF7核心启动子调控方面具有关键性的正调控作用。以上结果为IRF3和IRF7在天然免疫转录调控深入研究奠定了基础。
【图文】：
言 真核生物的转录调控基因表达是指基因经过一系列步骤表现出来其储存遗传信息。基因表达是经过多层次级别的过程，其各个阶段经过了从基因转录激活再到合成蛋白质的过程。也就是说，基因表达包含以下四个方面：转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平的调控，基因表达调最为重要的是转录水平的调控[1]。基因的转录水平调控需要顺式调控元件和反式作用因子的和共同作用，才能达到对特定基因进行调控的目的[2]。真核生物基本上由三部分组成：转录5’上游区和 3’下游区。5’上游区是转录起始点上游的 DNA 序列，包括启动子区和增强区[1]子区临近转录区，一般位于转录起点上游数百个碱基之内；增强子区则可能位于远达几千基的上游区域；3’下游区往往也是增强子区[1]。
进行刺激 12h，，刺激结束后对样品进行收集，用 PBS 洗 3 遍，加入双荧光素酶试剂盒中的细解液室温裂解 15min，收集细胞裂解液。（3）IRF3启动子双荧光素酶活性的检测用 Promega 的双荧光素酶检测试剂盒进行双荧光素酶的检测，具体步骤按照说明书操作步行：首先分装及配置 LARⅡ及 Stop & Glo Reagent，调试单管型发光检测仪，取 10μL 的细解液样品，加入到 50μL 的 LARⅡ检测液中，点击“Measure”键，读取萤火虫荧光素酶的数最后加入 50μL Stop & Glo Reagent终止液，读取内参对照海参荧光素酶的数值，萤火虫荧酶的数值与海参荧光素酶的数值的比值即为启动子双荧光素酶的活性。利用 GraphPad 软件数据，分析启动子活性。.4 IRF3 基因启动子核心功能区域鉴定4.1 IRF3 截短片段双荧光素酶报告基因系统的构建（1）引物的设计及合成根据扩增得到的 IRF3 启动子序列为参考，扩增特异性 IRF3 启动子基因截短序列上下游引物F3 基因启动子各缺失片段具体引物设计分别参照图 2-1)。所用引物见表 2-5。表 2-1 中上游的酶切位点均为 Kpn I，下游为 Xho I，划线处为酶切位点的位置。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
本文编号：2679928
【图文】：
言 真核生物的转录调控基因表达是指基因经过一系列步骤表现出来其储存遗传信息。基因表达是经过多层次级别的过程，其各个阶段经过了从基因转录激活再到合成蛋白质的过程。也就是说，基因表达包含以下四个方面：转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平的调控，基因表达调最为重要的是转录水平的调控[1]。基因的转录水平调控需要顺式调控元件和反式作用因子的和共同作用，才能达到对特定基因进行调控的目的[2]。真核生物基本上由三部分组成：转录5’上游区和 3’下游区。5’上游区是转录起始点上游的 DNA 序列，包括启动子区和增强区[1]子区临近转录区，一般位于转录起点上游数百个碱基之内；增强子区则可能位于远达几千基的上游区域；3’下游区往往也是增强子区[1]。
进行刺激 12h，，刺激结束后对样品进行收集，用 PBS 洗 3 遍，加入双荧光素酶试剂盒中的细解液室温裂解 15min，收集细胞裂解液。（3）IRF3启动子双荧光素酶活性的检测用 Promega 的双荧光素酶检测试剂盒进行双荧光素酶的检测，具体步骤按照说明书操作步行：首先分装及配置 LARⅡ及 Stop & Glo Reagent，调试单管型发光检测仪，取 10μL 的细解液样品，加入到 50μL 的 LARⅡ检测液中，点击“Measure”键，读取萤火虫荧光素酶的数最后加入 50μL Stop & Glo Reagent终止液，读取内参对照海参荧光素酶的数值，萤火虫荧酶的数值与海参荧光素酶的数值的比值即为启动子双荧光素酶的活性。利用 GraphPad 软件数据，分析启动子活性。.4 IRF3 基因启动子核心功能区域鉴定4.1 IRF3 截短片段双荧光素酶报告基因系统的构建（1）引物的设计及合成根据扩增得到的 IRF3 启动子序列为参考，扩增特异性 IRF3 启动子基因截短序列上下游引物F3 基因启动子各缺失片段具体引物设计分别参照图 2-1)。所用引物见表 2-5。表 2-1 中上游的酶切位点均为 Kpn I，下游为 Xho I，划线处为酶切位点的位置。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【参考文献】
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本文编号：2679928
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