致猪腹泻病毒快速检测方法研究及分子流行病学调查

发布时间：2020-05-25 09:29

【摘要】：猪腹泻目前对我国养殖业造成了巨大的经济损失,严重制约着我国生猪养殖业的发展,导致的猪腹泻病原有许多,猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒是近年来发生腹泻中最常见的。尤其这些病毒可以导致严重仔猪腹泻,危害极大。本文根据GenBank中上传序列,针对三种病毒保守基因PEDVN基因、TGEVN基因、PRoV VP7基因设计了三对特异性引物,建立了三重RT-PCR检测方法,并对建立的RT-PCR检测方法反应体系和条件进行了优化。结果显示建立的三重RT-PCR检测方法具有良好的敏感性和特异性,能有效地应用于三种病毒的流行病学调查。对应用本实验室已有两株PEDV单克隆抗体mAb-PEDV-2C11和mAb-PEDV-lC12建立的胶体金快速检测PEDV方法进行优化,对胶体金试纸条的金标垫、样品垫进行处理优化,结合实验室已有硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Filter Membrane)种类对NC膜进行选择,对标记抗体浓度进行优化。最终确定选用0.02 M PB(pH=8.5)、0.2%吐温-20、1.5%BSA溶液对金标垫进行处理,0.8%的硼酸溶液对样品垫进行处理,选择使用1A/ANC膜作为最终NC膜使用,2 mg/mL的mAb-PEDV-lC12作为标记抗体,优化后的检测效果较优化前灵敏度有了较大提升,比优化前提升了8倍。初步建立PLA(Proximity Ligation Assay)检测猪流行性腹泻病毒方法,使用生物素B结合实验室已有两株PEDV单克隆抗体mAb-PEDV-1C12、mAb-PEDV-2Cll形成探针a(Probe a)和探针b(Probe b),由于单克隆抗体具有特异性从而与抗原结合,两探针在小于40 nm范围可以自发结合形成模板,用realtime PCR可以检测到,可以直接用检测到的阴性与阳性差值确定病料中病毒含量,从而省去对病料的RNA提取过程,大大缩短了检测PEDV病毒所需时间。最终结果显示建立的PLA检测猪流行性腹泻病毒方法能对阳性样品和阴性对照进行有效区分。该方法还有待进一步优化,以适应临床检测的需要。对江苏扬州、盐城、连云港、常州、河南、广西等地区养猪场进行粪便和肠道样品收集,利用建立好的三重RT-PCR方法对收集到的982份病料进行检测,结果显示总PEDV阳性检出率为9.1%(90/982),TGEV阳性检出率为0.1%(1/982),PRoV阳性检出率为0.2%(2/982)。其中江苏盐城若干家规模养殖场送检的80份样品检测结果阳性率为26.2%(21/80),说明目前PED流行情况仍然存在且较为严重,同时在对盐城采集的样品检测过程中发现1例PEDV、TGEV混合感染,2份PRoV阳性,说明猪场存在不同腹泻病毒共感染情况。将阳性病料的PEDVORF3片段与NCBI上序列进行比较发现,河南地区主要流行株与CV777、DR13等经典株较接近,江苏地区主要流行PEDV核苷酸序列与美国、泰国、韩国毒株接近,说明我国目前流行性腹泻地区流行性差异较明显。
【图文】：

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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

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