胆固醇对能量负平衡奶牛肝脂代谢的影响

发布时间：2020-05-25 19:04

【摘要】：围产期奶牛易发能量负平衡,游离脂肪酸(NEFA)被大量释放在肝脏内酯化形成甘油三酯蓄积。极低密度脂蛋白(VLDL)将甘油三酯运出肝外是清除蓄积的主要方式,胆固醇是合成VLDL的主要成分。然而,能量负平衡导致的奶牛肝脏内胆固醇代谢调节机制仍未清晰。据此,本研究通过奶牛血液胆固醇含量与其他生化指标的分析,明确胆固醇对围产期奶牛健康的影响特征;通过体外培养犊牛肝细胞添加NEFA模拟能量负平衡状态并添加胆固醇,运用蛋白质组学与代谢组学技术来阐明胆固醇在NEFA介导的犊牛肝细胞脂质沉积中的作用,揭示胆固醇对能量负平衡时肝脂代谢的调控机制,对围产期奶牛脂肪肝发病机理及防治措施有重要意义。本研究包括四个实验:1)在黑龙江某集约化牛场采集产前2周到产后14天奶牛血液。依据产前2周血中胆固醇(TC)含量将试验牛分成高血胆固醇组(14头)和低血胆固醇组(14头),对试验牛血中能量、血脂、肝功等指标水平进行组间独立样本T检验和Pearson相关分析。2)应用两步胶原酶灌流法分离犊牛肝细胞,体外培养48 h后,饥饿培养6 h,添加1.2 m M NEFA,继续培养细胞12 h,建立肝细胞脂质沉积模型。采用时间梯度与密度梯度法,通过对NEFA、TG、AST和GLO等肝细胞脂代谢敏感指标分析,确定胆固醇添加的最佳浓度及最佳时间。3)在确立胆固醇添加的时间及浓度后,应用iTRAQ技术检测(胆固醇组与空白组、酸+醇组与游离脂肪酸组)犊牛肝细胞样品,获得组间的差异蛋白,再进行GO富集与KEGG分析,确定差异蛋白的代谢通路。4)应用GC/MS技术检测(胆固醇组与空白组、酸+醇组与游离脂肪酸组)犊牛肝细胞样品,获得组间的差异代谢物,再进行生物信息学分析,确定差异代谢物的代谢通路。结果显示:1)高血胆固醇(H)组奶牛血液TC水平极显著高于低血胆固醇组(L)奶牛(P0.01)。H组奶牛血液TG水平在产前2周、产前1周、分娩当天显著低于L组(P0.05);在产后7天极显著低于L组(P0.01)。H组奶牛血液HDL-C和LDL-C水平显著高于L组(P0.01)。在产前1周、分娩当天和产后7天H组与L组相比NEFA显著降低(P0.05)。在分娩当天H组与L组相比Mg水平显著升高(P0.05)。在产后7天H组与L组相比AST显著降低(P0.05);在产前1周、分娩当天和产后7天H组与L组相比Ca显著升高(P0.05)。2)通过对NEFA诱导的肝细胞脂质沉积中添加不同浓度胆固醇的结果显示,添加胆固醇可以缓解肝脂沉积状态,胆固醇最佳添加浓度与时间为50μm/d L和6 h。3)对iTRAQ检测的结果进行GO分析,胆固醇组与空白组相比筛选了差异蛋白138个,其中有50个表达上调(ratio1.2,P0.05)的蛋白,88个表达下调(ratio0.83,P0.05)的蛋白。酸+醇组与游离脂肪酸组相比筛选了差异蛋白66个,其中有41个表达上调(ratio1.2,P0.05)的蛋白,25个表达下调(ratio0.83,P0.05)的蛋白。上调蛋白有3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)、己糖激酶(HK2)、山梨醇脱氢酶(SORD)和载脂蛋白C-III(APOC3)等。下调蛋白有脂肪酸结合蛋白(FABPS)等。筛选差异蛋白发现主要参与糖酵解与PPAR等通路。4)通过GC/MS检测和多元统计分析,空白组与胆固醇组对比共有28个差异代谢物,其中有15个代谢物含量降低,如丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等;13个代谢物含量升高,如乳酸糖、前列腺素E2等;酸+醇组与游离脂肪酸组对比共有17个差异代谢物,其中水杨酸胆甾烷-3,5,6-三醇代谢物含量降低;16个代谢物含量升高,如苏氨酸、腺嘌呤、亚油酸甲酯、水杨酸、瓜氨酸等。这些差异代谢物主要参与糖异生与类固醇合成的代谢通路。结论:围产期奶牛血液高胆固醇水平可降低产后低血钙和能量负平衡相关疾病的发生;NEFA介导的肝细胞脂质沉积实验中,胆固醇通过上调3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)、己糖激酶(HK2)和山梨醇脱氢酶(SORD)来激活糖酵解途径,减轻能量负平衡状态;胆固醇通过上调APOC3,下调FABPS,进而激活PPAR通路,促进VLDL合成加快TG清除,减少脂质沉积。
【图文】：

图 2-1：标准曲线Figure 2-1: Standard curve曲线公式：y=0.7348x2+0.467x，，R2=0.9983公式计算各样品蛋白浓度（见表 2-6）

胆固醇对能量负平衡奶牛肝脂代谢的影响21图3-1 生物进程富集统计（P< 0.05）Figure 3-1 Biological process gene ontology statistics（P< 0.05）通过对细胞组分富集统计分析，差异蛋白显著富集的有17个（P＜0.05），其中极显著富集的有8个（P＜0.01），结果表明差异蛋白主要表达在细胞核、线粒体、线粒体内膜、内质网上（见图3-2）。图3-2 细胞组分富集统计（P< 0.05）Figure 3-2 Cellular component gene ontology statistics（P< 0.05）通过对分子功能富集统计分析，差异蛋白显著富集的有12个（P<0.05），其中极显著富集的有5个（P<0.01），主要分子功能包括甘
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】

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本文编号：2680603