QKI对猪睾丸支持细胞增殖与分泌因子影响的研究

发布时间：2020-05-25 15:50

【摘要】：睾丸支持细胞(Sertoli Cell,SC)是启动性机能发育和维持成年精子发生的上皮细胞,与生精细胞直接接触并为生精细胞提供营养,分泌多种细胞因子,调节精原干细胞分化,维持精子发生,吞噬精子发生过程中的残余胞质和分泌睾丸液等重要功能。作为一种终末分化细胞,支持细胞在性成熟后就停止增殖。每一个支持细胞滋养的生精细胞数量有限,所以支持细胞增殖数量直接影响成年动物睾丸大小和生精数量,而性成熟后支持细胞维持生精微环境的稳态,决定了动物精子的质量。因此,支持细胞增殖与分泌直接影响着公猪的繁殖力。RNA结合蛋白QKI是STAR家族成员之一,具有RNA信号转导激活功能。主要通过特异性结合3’UTR中含有QRE原件(QRE序列:ACUAAY-N(1-20)-UAAY,Y=U/C)的Pre-mRNA和成熟的mRNA,以参与调控多种组织发育、细胞增殖和分化。因此,本实验通过探究QKI在猪睾丸未成熟支持细胞中的靶基因,进而研究QKI对支持细胞增殖和分泌因子的影响,结果可为研究支持细胞增殖和分泌功能的调控机制提供基础。1.支持细胞的分离、纯化与标志蛋白的鉴定首先,采集21日龄仔猪睾丸,用两步酶消化的方法获得细胞,并用差异性贴壁的方法纯化细胞;通过形态学观察,细胞形状呈椭圆形或圆形,有多个突起,细胞形态不规则,200倍和400倍显微镜下可清晰观察到细胞核周边有两个卫星核小体;通过计算免疫荧光标记支持细胞标志蛋白GATA-4、WT-1和FASL在细胞中的染色比率,确定支持细胞的纯度接近100%;通过未成熟支持细胞标志蛋白KRT-18,最终确定分离纯化的细胞为猪睾丸未成熟支持细胞。2.QKI靶基因mRNA序列分析与RIP-seq验证随后,我们通过Ensemble网站导出猪基因组所有mRNA的3’UTR,得到5445个基因的3’UTR中含有QRE元件。又采用RIP-seq技术,用QKI抗体特异性识别“QKI-mRNA”的复合体,经蛋白酶消化和纯化后,进行mRNA转录组测序,差异表达2倍以上的基因有3551个。两种结果交集分析,既含有QRE元件,又在转录组测序中出现的mRNA有1379个,其中包括前期研究验证过的7个基因,再随机选取10个基因进行RT-PCR验证,同转录组测序结果基本一致。通过KEGG和Go分析,发现QKI结合的mRNA有13个基因集中参与细胞周期(cell cycle)通路中,其中包括与增殖有密切关系的PCNA。这意味着QKI可能对支持细胞周期和增殖有影响。3.QKI对支持细胞增殖与分泌因子影响的研究然后,将过表达载体和干扰载体分别转染支持细胞,过表达QKI组细胞周期通路中PCNA的mRNA含量显著增加(P0.01);干扰QKI组PCNA的含量显著降低(P0.01);检测QKI对细胞周期的影响,结果显示当过表达QKI时,pBI-CMV3-QKI组支持细胞的S期明显高于对照组pBI-CMV3(P0.05),而干扰QKI表达时,shQKI组支持细胞的S期明显低于对照组shNC(P0.05);通过分析QKI对细胞活力的影响,发现pBI-CMV3-QKI组与对照组pBI-CMV3相比,在72h时细胞活力明显增强,细胞增殖加快,差异显著(P0.01),而干扰QKI后,在72h时shQKI组细胞活力显著低于对照组shNC,差异显著(P0.01);最后测定QKI对细胞因子ABP、EGF、GDNF和IGF-1分泌的影响,当过表达QKI时,pBI-CMV3-QKI组EGF、GDNF和IGF-1分泌显著高于pBI-CMV3组,而对于ABP的分泌无显著差异。结论:在猪睾丸未成熟支持细胞中,QKI通过结合细胞周期多个相关基因的mRNA,促进细胞增殖,同时具有促进GDNF、IGF-1和EGF分泌的功能,其调控的分子机制还有待深入研究。
【图文】：

图 1 支持细胞从胎儿、性发育期到成年的发育成熟过程中，成熟或不成熟的蛋白质标记物表达的变化Figure 1 Schematic diagram illustrating normal (and abnormal) maturationaldevelopment of Sertoli cells from fetal life through puberty to adulthood, and the

图 2 人、猕猴、恒河猴和大鼠的生长时期与支持细胞的增殖曲线gure 2 Schematic diagram illustrating timing of proliferation of Sertoli celmans, rhesus and marmoset monkeys, and rats in relation to birth, the neonperiod and puberty.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828

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本文编号：2680381