【摘要】：目的:犊牛腹泻是牛养殖业中最常见的具有多发性和传染性的疾病之一,目前主要通过抗生素防治该病,但由于抗生素的长期、大量使用,造成耐药菌株的产生,不仅降低了抗生素的治疗效果,还带来了药物残留等问题,间接危害了人们的身体健康。因此,研究者们一直在寻找相关替换或辅助性药物的研究,其中抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)的研究备受研究者广泛的关注。但由于犊牛是大型经济动物,直接以犊牛作为试验对象会存在很多问题,而小鼠因其个体小、繁殖周期短经常作为医学领域研究的重要模型动物,因此,可以把小鼠作为犊牛腹泻感染、发病和治疗等研究的替换模型动物。抗菌肽是生物体防御外界病原体侵袭产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽,其抑菌作用机制不同于抗生素,不会产生药物残留,也不易产生耐药性。生物界中数量庞大易繁殖的蝇蛆体内含有丰富的抗菌肽,使其在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中还能健康地生长繁殖。因此,采用家蝇幼虫-蝇蛆做为实验材料,利用犊牛腹泻粪便中分离的致病性大肠杆菌,诱导蝇蛆产生高表达量的蝇蛆抗菌肽,为了研究蝇蛆抗菌肽替换或辅助抗生素对致病性大肠杆菌引起犊牛腹泻的治疗效果,本试验从犊牛腹泻粪便中分离出致病大肠杆菌,将分离出的大肠杆菌灌胃小鼠建立大肠杆菌致小鼠腹泻的病理模型,再用蝇蛆抗菌肽治疗腹泻的小鼠,观察在治疗过程中小鼠临床症状的变化,检测小鼠十二指肠中的肿瘤坏死因子(TNF-α)含量和大肠杆菌和乳酸杆菌菌落数的变化情况,以及小鼠血清中IL-6的含量及小鼠腹泻治愈率等,为今后将蝇蛆抗菌肽替换或辅助抗生素治疗致病大肠杆菌引起的犊牛腹泻提供理论依据。方法:试验一:致犊牛腹泻大肠杆菌的分离及鉴定无菌采集10日龄犊牛腹泻的粪便,进行细菌的分离培养,对分离菌株进行染色镜检、PCR鉴定及分离菌株对小鼠致病性的试验研究。试验二:蝇蛆抗菌肽对致犊牛腹泻大肠杆菌抑菌活性的研究(1)蝇蛆抗菌肽的粗提及纯化;(2)利用考马斯亮蓝法测定蝇蛆抗菌肽的浓度;(3)蝇蛆抗菌肽最小抑菌浓度测定;(4)采用K-B纸片法对大肠杆菌进行蝇蛆抗菌肽和恩诺沙星的敏感性试验。试验三:犊牛腹泻大肠杆菌性小鼠腹泻模型的建立将从犊牛腹泻粪便中分离出来的致病大肠杆菌,制备成不同浓度的大肠杆菌悬浮液灌胃小鼠,通过记录察小鼠的临床症状、小鼠体重变化和测定腹泻小鼠粪便中大肠杆菌数、小鼠死亡率和腹泻率,进行构建大肠杆菌性小鼠腹泻模型。试验四:蝇蛆抗菌肽对大肠杆菌性小鼠腹泻治疗效果的研究(1)将试验小鼠分成4组,为空白对照组,生理盐水组、抗生素(恩诺沙星)组及蝇蛆抗菌肽治疗组,于治疗1d、3d、5d采集各试验组小鼠十二指肠组织样品,观察组织病理变化及治疗效果;(2)通过ELISA法检测小鼠十二指肠中TNF-α的含量和大肠杆菌及乳酸杆菌菌落数。(3)通过ELIS测定腹泻小鼠血清中IL-6的含量。结果:1.对犊牛粪便中分离出来的细菌进行分离培养、染色镜检、PCR鉴定以及小鼠致病性等试验,获得了致犊牛腹泻的致病性大肠杆菌。2.蝇蛆抗菌肽对犊牛腹泻大肠杆菌药物敏感性试验的结果表明,蝇蛆抗菌肽对犊牛腹泻大肠杆菌的抑菌圈为(12.72±0.69mm)低于抗生素(恩诺沙星)的抑菌圈(19.87±0.51mm);采用微量肉汤稀释法检测经犊牛腹泻大肠杆菌诱导的蝇蛆抗菌肽和抗生素(恩诺沙星)对大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为2.19ug/mL、1.56ug/mL。3.给小鼠灌胃1×10~8CFU/mL、2×10~8CFU/mL、3×10~8CFU/mL、4×10~8CFU/mL、5×10~8CFU/mL的大肠杆菌菌悬液,通过小鼠的临床症状变化和体重的下降以及腹泻小鼠粪便中大肠杆菌数量的增多、腹泻率和死亡率的升高,筛选出致小鼠腹泻的大肠杆菌浓度为4×10~8CFU/mL,成功构建小鼠腹泻病理模型。4.应用蝇蛆抗菌肽治疗小鼠腹泻模型,分别于治疗1d、3d、5d采集小鼠的十二指肠组织,检测小鼠十二指肠中TNF-α、小鼠血清IL-6的含量和小鼠十二指肠中大肠杆菌和乳酸杆菌数以及小鼠腹泻治愈率。(1)通过ELISA方法检测小鼠十二指肠中TNF-α的含量结果显示,与生理盐水组比较,在治疗的第1d、3d、5d,蝇蛆抗菌肽治疗组的小鼠十二指肠中TNF-α的含量显著下降(P0.01);(2)采用蝇蛆抗菌肽治疗腹泻小鼠,对小鼠十二指肠中大肠杆菌及乳酸杆菌数进行活菌计数的结果发现,治疗过程中,1d、3d、5d的蝇蛆抗菌肽治疗组的小鼠十二指肠中大肠杆菌数呈极显著降低(P0.01),小鼠十二指肠中的乳酸杆菌数呈极显著升高趋势(P0.01)。(3)治疗结束后,通过ELISA法检测小鼠血清中IL-6的含量结果显示,抗生素治疗组和蝇蛆抗菌肽治疗组IL-6的含量显著低于生理盐水组(P0.05)。(4)腹泻小鼠十二指肠中的大肠杆菌数推断小鼠的治愈率的结果显示,生理盐水治疗组小鼠的治愈率为27%,抗菌肽治疗组为46%,抗生素(恩诺沙星)治疗组为60%。结论:蝇蛆抗菌肽对犊牛腹泻大肠杆菌性腹泻小鼠有一定的治疗效果,虽然蝇蛆抗菌肽的治愈率低于抗生素(恩诺沙星)组,但蝇蛆抗菌肽和抗生素同样对腹泻小鼠有治疗作用,说明蝇蛆抗菌肽可以用于治疗腹泻小鼠。
【图文】：
革兰氏染色镜检结果
蛋白浓度侧定标准曲线
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【参考文献】
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2680113
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