p53对重组鸽α干扰素抗病毒作用的影响

发布时间：2020-05-26 01:00

【摘要】：干扰素α(IFN-α)是细胞先天防御病毒侵染的第一道防线,其对各种类型细胞的功能都有广泛的影响。近些年来,动物IFN的研究主要集中于经济动物,并取得了一定进展,目前市场上商品化的鸡、犬、猪重组IFN产品已应用于实践。然而,迄今为止,鸽IFN-α的抗病毒反应信息以及机制特点还没有被报道。在过去的几十年里,鸽子的数量在欧洲的许多国家成指数增长,其密度已经超过了 2000只/km2。由于许多病毒是在鸽子的呼吸道和胃肠道中复制,所以在集约化养殖中病毒更容易通过粪口或气溶胶传播。然而,在一定程度上由于鸽的免疫耐受性、病毒的高突变率和感染宿主的因素,疫苗对某些病毒的控制还未取得完全的成功。此外,由于禽类养殖行业的病毒性疾病的问题日益严重,所以人们越来越侧重于对禽类IFN-α的研究。因此,对鸽IFN-α的特征和相关信号通路的明确可以避免鸽养殖产业的经济利益损失。在本研究中,我们克隆了 723bp鸽IFN-α的ORF区,编码240个氨基酸。与哺乳动物IFN-α的同源性小于40%,与禽IFN-α基因的同源性在54～80%之间,其中与丹顶鹤的亲缘关系最近,同源性高达79.49%。鸽IFN-α成熟肽亚克隆到原核表达载体pET32a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析,原核表达的鸽IFN-α成熟肽融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约43KDa。重组鸽IFN-α可以抑制水泡性口炎病毒(VSV)的复制,其生物活性最高时达到5.5 × 105U/mg。此外,胰酶处理后,鸽IFN-α失去原有的抗病毒活性,然而在酸碱、低高温处理后,其活性仍是稳定状态。鸽IFN-α可以通过激活STAT/Jak和PI3K-AKT-mTORC通路,以此来抑制VSV诱发的凋亡现象。尽管在预孵育鸽IFN-α后,p53的表达水平进一步上升,但是鸡胚成纤维细胞并没有发生凋亡。值得注意的是,虽然STAT信号通路被有效的激活,但是p53敲低后却是抑制鸽IFN-α的抗病毒活性,减少抗病毒蛋白Mx1的表达水平,不过并没有减弱Jak的磷酸化作用。此外p53敲低后,VSV表现出加剧凋亡信号通路并且诱导了 cleaved-Mdm2的蛋白表达。总之,p53在鸽IFN-α抗病毒过程中可能发挥一种高度互联调节剂的作用。有趣的发现是在病毒侵染中,cleaved-Mdm2可能作为一个主要负调控器而绑定p53。本研究不仅丰富了鸽IFN-α抗病毒特性特点,并且有助于解释p53增强鸽IFN-α抗病毒的根本原因。通过本研究,我们首次获得了鸽IFN-α基因,在大肠杆菌表达相应蛋白,并证明在对VSV的抑制率强于鸡IFN-α。此外我们从自噬和凋亡方面来探究p53在鸽干扰素α抗病毒的作用。我们实验数据说明:(1)鸽IFN-α可以保护病毒诱导的细胞凋亡;(2)鸽IFN-α在抗病毒过程中是通过激活PI3K/AKT/mTORC通路来诱导自噬;(3)p53的敲低可以抑制鸽IFN-α抗病毒反应;(4)在p53被抑制表达的情况下,cleaved-Mdm2可能起到积极调解鸽IFN-α抗病毒功能的作用。
【图文】：

ＳＴＡＴ５－ＣｒｋＬ异二聚体［２９］。为响应ＩＦＮ的刺激，ＳＴＡＴ５与Ｔｙｋ２相互作用以及其经过磷逡逑酸化作用，之后ＣｒｋＬ通过ＳＨ２区域绑定酪氨酸磷酸化的ＳＴＡＴ５。ＳＴＡＴ５－ＣｒｋＬ异质二逡逑聚体复合物易位到细胞核内以达到绑定ＧＡＳ原件（ＴＴＣＴＡＧＧＡＡ）（图１－１所示）。逡逑ＩＦＮ邋ｓｔｇｎａＨｍｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑Ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ＩＦＮｓ逦Ｔｙｐｅ邋ＩＩ邋ＩＦＮ逦Ｔｙｐｅ邋ＩＩＩ邋ＩＦＮａ逡逑＾逦ｆ邋ＩＦＮＧＲ－１逦ＩＬ－１０Ｆ？２逦＼逡逑．ｆｎａｒ．ｉ＿Ｉ（￡１ｆｎａｒ．２逦＼r>逡逑＾￡ｒ逡逑ｄ晰、逦抱，逦忠＝逦ａａｆ／ｇａｆ逡逑－－．．．．．—…．逡逑－［ＧＡｉｊ－ｃ＾邋￣ｎ§ｉＨ＝＾逡逑ＩＳＧ１５逦ｔＦＮ－ｔ逦ＩＲＦ－１逡逑ＩＰ－Ｗ逦ｔＲＦ－２逡逑ＩＲＦ－５逦ｉＲＦ－ｅ逡逑ＩＲＦ－７逦ＩＲＦ－９逦＆ｔｃ．逡逑ｓｔ．ｓ－ｏａｓ逡逑ＰＫＲ邋＆ｔｃ．逡逑图Ｍ干扰素信号通路逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑１．４邋Ｉ型ＩＦＮ对病毒的控制和免疫调节逡逑１．４．１病毒侵染后的先天性免疫受体通路逡逑在病毒侵染宿主细胞时，会诱发多种细胞因子和趋化因子的产生。而Ｉ型ＩＦＮ是参逡逑与抗病毒反应的主要的一类因子＃邋３１］。然而先天免疫的第一步是对病原微生物的识别，，逡逑ＴＬＲ３邋可以识别双链邋ＲＮＡ邋病毒，并通过邋ＴＲＩＦ邋（ＴＩＲ邋ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ａｄａｐｔｅｒ邋ｉｎｄｕｃｉｎｇ逡逑ＩＦＮ－卩

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本文编号：2681025