NA蛋白影响H3N2亚型犬流感病毒复制的分子机制

发布时间：2020-05-26 03:49

【摘要】：2007年以来,亚洲新发H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)在我国广泛流行,引起犬急性传染病—犬流感。研究发现,H3N2 CIV来源于禽源H3N2亚型流感病毒,经变异演化后感染的犬。早期的实验结果表明,H3N2 CIV可通过空气在犬间传播,也可继续感染其它哺乳动物,包括鼠和豚鼠,但丧失对禽的感染力。禽源的H3N2 CIV对犬的致病机制到底如何,目前尚不清楚。HA和NA基因在流感病毒的致病方面起着重要作用。鉴于此,本研究用禽源病毒的HA或NA单基因替换掉H3N2 CIV的相应基因,并拯救获得了以H3N2 CIV为背景的重组病毒。将这些重组病毒感染BALB/c小鼠,确定了H3N2 CIV复制的关键基因及其氨基酸位点,并深入探讨影响其复制的致病机制,具体内容如下:1.确定H3N2 CIV复制的关键基因本研究早期筛选到了两株高度同源的病毒,一株引起犬发病的犬流感病毒A/canine/influenza virus/01/2010(H3N2)(简称为C1)和一株不感染犬发病的禽流感病毒A/duck/shanghai/06/2009(H3N2)(简称为)D6,并建立这两株病毒的反向遗传操作系统。拯救得到与原毒株基因序列一致的重组病毒,分别命名为rC1和rD6。用D6毒株的HA或NA单基因替换C1对应基因,并拯救得到以C1为背景的两株重组病毒,分别命名为C1-D6HA和C1-D6NA。通过滴鼻途径感染5周龄BALB/c小鼠,10~6EID_(50)/只。结果表明,亲本毒rC1在鼠的肺脏中复制良好,而C1-D6NA基本上无法复制。同时,通过病理组织学观察发现,感染了rC1毒株的小鼠肺脏有明显的病理变化,而感染C1-D6NA毒株的小鼠肺脏基本无病理变化。根据这些结果,我们认为CIV的NA基因可能是该病毒致病的关键基因。2.确定H3N2 CIV复制的关键氨基酸位点利用Lasergene 7.0软件分析和比较了大量H3N2亚型犬流感病毒和同亚型的禽流感病毒的NA序列,最后在CIV的NA蛋白序列上锁定了4个可疑的氨基酸位点,构建相应的pBD突变质粒,并拯救获得了4株点突变重组病毒,分别命名为C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)。小鼠致病性实验表明,亲本毒rC1和C1-NA(L24M)、C1-NA(G430R)病毒在鼠的肺脏上皆能良好复制,但C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)重组病毒无法在鼠肺脏中复制。进一步地犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)增殖试验结果与鼠的致病性结果相似。因此,我们认为C1-NA的54K和154S可能是H3N2 CIV致病的关键氨基酸位点。3.H3N2 CIV复制的分子机制酶活性是流感病毒NA蛋白重要的功能之一。那么,CIV-NA的54K和154S是否通过调控NA蛋白的酶活性,从而影响H3N2 CIV的致病性呢?为此,利用无特异性病原(Specific pathogen free,SPF)鸡胚扩增rC1及其NA点突变重组病毒C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R),检测NA酶活性。结果发现重组病毒C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)的NA酶活性明显低于rC1及其他2株重组病毒C1-NA(L24M)和C1-NA(G430R),即54K和154S可显著增强H3N2 CIV的NA酶活性。这种NA酶活性的改变,是否会影响病毒的释放呢?为此,我们进行了红细胞病毒释放试验和子代病毒在MDCK上的释放试验。两个试验的结果皆表明,与rC1及其它2株重组病毒相比,C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)能显著减缓病毒在细胞膜上的释放能力。综上所述,本研究发现H3N2 CIV通过54K和154S增加NA蛋白的酶活性,促进病毒在细胞膜上的释放能力,从而有助于该病毒对哺乳动物的感染与复制,为进一步有效防控该疫病提供了理论依据。
【图文】：

流感病毒,粒子结构

白(Nucleoprotein , NP)和基质蛋白(Matrix, M)的抗原性的不同近年来有研究者在猪和牛体内分离到新型的流感病毒，将其命15; Hause et al., 2013)。A 型流感病毒对人和动物的危害最为感大爆发。由于庞大的 A 流感病毒毒株，因此在核蛋白抗原tinin, HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性进行亚型有 18 种(H1-H18)，神经氨酸酶共有 11 种(N1-N11)，除从蝙型以外(Tong et al., 2012)，其余 16 种 HA 和 9 种 NA 表面抗原型，如 H5N1 (Hatta et al., 2001)、H1N1 (Abed et al., 2004)、H9N al., 2013)等。20 世纪至今，，先后多次暴发的全球性大流感不胁着人类的健康。因此，密切关注流感病毒的流行情况，深跨宿主传播机制对控制流感的暴发具有十分重要的作用。原学特点形态多样，呈球状，丝状，棒状等，但一般成熟的病毒粒子 100nm。病毒粒子由外到内分别是双层囊膜，基质蛋白和核心

电泳图,电泳,氨基酸,测序

图 2.1 C1 和 D6 全基因 PCR 电泳结果Fig.2.1 PRC products of 8 genes of C1 and D6A:C1, B:D6, M1:DL2000Marker, 1:PB2, 2:PB1, 3:PA, 4:HA, 5:NP, 6:NA, 7:M, 8:NS, 9:空白2.3.2全基因序列测序结果C1 和 D6 全基因组的 8 个基因片段的测序结果表明，各个基因的长度和氨基酸个数如下表(表2-6)。表 2.6 C1 和 D6 分离株碱基和氨基酸个数Table2.6 Numbers of basic group and amino acid of C1 and D6基因片段长度(nt) 氨基酸个数(aa)C1-PB2 2342 760C1-PB1 2341 759C1-PA 2233 717C1-HA 1765 567C1-NP 1565 499C1-NA 1473 472
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】