【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的母猪的繁殖障碍和生长猪呼吸系统疾病为主要特征的高度接触性传染病。近年来,我国PRRSV感染仍十分普遍,给养猪业造成了严重的经济损失。疫苗免疫是当前防控PRRS的最有效的措施,对控制PRRS的发生和传播起到了积极的作用。目前用于生产实践中的疫苗主要有商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗,但对其免疫效果缺乏较完善的评价体系,且各养殖场(户)对PRRS疫苗的使用效果也众说纷纭。已有研究证实PRRS弱毒疫苗与灭活疫苗联合使用能产生更好的免疫保护效果,但对其免疫特性了解尚浅。因此,本试验采用商品化的经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)和高致病性PRRS灭活疫苗(NVDC-JXA1株)以不同组合方式对仔猪免疫接种,通过疫苗免疫后的安全性评价、诱导的体液免疫和细胞免疫应答效果进行分析研究,以期为不同组合PRRS疫苗的免疫特性的研究奠定一定理论基础和免疫程序提供可行依据,为PRRS的有效防控提供科学指导。1.荧光定量RT-PCR检测方法的建立根据GenBank中PRRSV基因序列,设计一对针对N基因扩增的特异性引物,经RT-PCR扩增后连接到pMD19-T载体上,构建含有N基因片段的重组质粒。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量RT-PCR扩增,建立标准曲线并进行特异性、敏感性及重复性试验。结果显示:所构建的方法扩增效率为1.063,相关系数R~2为0.999,标准曲线斜率值为㧟3.18,引物特异性强,可检测的最低核酸模板浓度为1.0×10~2copies/μL,比常规PCR敏感性高10倍,重复性试验的变异系数均小于1%。表明建立的荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性强、敏感性高和重复性好等优点,可用于PRRSV感染(包括疫苗毒)的快速检测。2.不同组合PRRS疫苗免疫仔猪的安全性评价筛选7~10日龄PRRSV抗原和抗体双阴性的仔猪40头,平均分为4组(3个试验组和1个对照D组),其中试验组(试验A、B、C组)仔猪均为14日龄首免经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),35日龄分别对试验A组和B组二免高致病性PRRS灭活疫苗(NVDC-JXA1株)和经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),试验C组注射生理盐水,对照D组于14日龄、35日龄均注射生理盐水。通过以上不同组合方式免疫仔猪的临床表现观察,平均日增重测定,荧光定量RT-PCR方法监测试验仔猪血清中PRRSV核酸和检测主要组织器官中的PRRSV核酸,并观察组织变化对其安全性进行评价。结果显示:试验组仔猪接种PRRS疫苗后与对照D组相比未发现明显的不良临床表现,采食状况、精神状态等无明显差异,体温均在正常范围内,增重无明显差异(P0.05);经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)对14日龄仔猪首免后血清中PRRSV核酸持续时间为3周,35日龄(免疫后21 d)二次加强免疫后,未在血清中检测到PRRSV核酸,至免疫后63 d仔猪主要组织器官中均未检测到PRRSV核酸存在,仅有部分组织存在轻微病理学变化。3.不同组合PRRS疫苗诱导仔猪体液免疫应答效果分析采用PRRSV N蛋白抗体和GP蛋白抗体检测试剂盒分别对不同组合PRRS疫苗免疫后的不同阶段的仔猪血清中特异性抗体变化情况进行监测。结果显示:试验组PRRSV N蛋白抗体在第14 d开始转为阳性,GP蛋白抗体在第21 d才开始转为阳性;免疫后35~63 d试验A、B两组与试验C组、对照D组N蛋白抗体水平差异极显著(P0.01)且C组与D组差异极显著(P0.01);免疫后35 d,试验A、C两组与B组GP蛋白抗体水平差异显著(P0.05);免疫后42~63 d,试验A、B两组与C组GP蛋白抗体水平差异极显著(P0.01),其中试验A组与B组在免疫后56~63 d差异显著(P0.05)。4.不同组合PRRS疫苗诱导仔猪细胞免疫应答效果分析采用ELISA方法分别对不同组合PRRS疫苗免疫后的不同阶段的仔猪血清中CD3、CD4和CD8分子表达量及细胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-10、IL-12的含量进行动态变化监测。结果显示:首免PRRS弱毒疫苗21 d内,试验组血清中的CD3、CD4分子表达量呈现升高趋势,而CD8分子表达量试验组和对照D组均无明显变化;免疫后第21 d加强免疫后,试验组血清中CD3、CD4分子表达量开始出现缓慢下降后趋于平稳;免疫后35、42 d,试验C组血清中CD8分子表达量显著高于试验A、B组和对照D组(P0.05);PRRS疫苗免疫后,TNF-α与IFN-γ的含量变化规律相一致,均呈现先上升后降低的趋势,其中第14 d时试验组均显著高于对照D组(P0.05),第21~42d时试验组均极显著高于对照D组(P0.01);免疫后28 d内,IL-2的含量呈现缓慢上升趋势,其中在免疫后第14 d,试验组与对照D组差异显著(P0.05);免疫28 d后,除了试验A组,试验B、C组均呈现缓慢下降趋势,其中免疫后49 d试验A组显著高于其它组(P0.05);IL-10的含量整体呈现先缓慢下降后上升的趋势,但试验组与对照D组无显著差异;IL-12的含量整体呈现先上升后缓慢下降的趋势,其中在免疫后21 d内,试验组IL-12的含量与对照D组无明显差异,但免疫后35 d和56 d,试验组IL-12的含量与对照D组差异极显著(P0.01),免疫后49 d,试验组IL-12的含量与对照D组差异显著(P0.05)。综上,本研究成功建立了检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法;证实了不同组合PRRS疫苗免疫仔猪具有良好的安全性;首免经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)和二免高致病性PRRS灭活苗(NVDC-JXA1株)的体液免疫应答效果优于单次及两次经典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),且首免PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)能有效诱导机体细胞免疫反应。
【图文】：
013 软件进行统计及整理，再行差异显著性检验，以 P＜异不显著为判断标准。法的建立性引物进行 RT-PCR 扩增，T-PCR 产物纯化、连接、转，克隆片段与 GenBank 中 阳性重组质粒。测定阳性M 1 2
贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文3.1.2 标准曲线绘制结果荧光定量 RT-PCR 最佳反应体系为 25 μL：模板 cDNA 2 μL，SYBR GreenⅠMix 12.5μL，上、下游引物各为 1 μL，灭菌 ddH2O 8.5 μL；最佳反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5s，56 ℃ 30 s，，72 ℃ 10 s，40 个循环。以不同稀释度标准质粒为模板建立的标准曲线（见图 2 A），表达式为：Y= -3.18X+40.04，相关系数 R2=0.999，扩增效率为 1.063；依据循环数（Ct 值）和荧光强度的关系，绘制出扩增曲线（见图 2 B），扩增曲线呈典型的S 型曲线，指数增长期曲线接近平行，反映了 PCR 扩增效率相近；熔解曲线为特异性单峰，Tm 值在 85 ℃左右，结果见图 2 C。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 王德康;;猪常用疫苗的使用方法[J];青海农牧业;2008年04期
2 王艳慧;;基层动物防疫疫苗的管理及相关问题思考[J];饲料博览;2019年02期
3 张芳;李玉;;小儿二类疫苗接种现状调查及其相关影响因素分析[J];南昌大学学报(医学版);2019年01期
4 玛依努尔·阿不都克力木;梁静;王培生;陈保林;尹钰;;乌鲁木齐市2012—2016年儿童入托入学预防接种查验情况[J];中国学校卫生;2017年09期
5 陈晓晓;;儿童疫苗接种的问题分析[J];科技风;2017年26期
6 杨媛;;流动儿童疫苗接种的及时率的影响因素分析[J];世界最新医学信息文摘;2018年17期
7 林玲;秦梦怡;胡晓江;;高校场域对学生疫苗接种的影响[J];南京医科大学学报(社会科学版);2018年03期
8 钱文昌;刘淑兵;王正奎;;浅议疫苗[J];中学生物学;2017年12期
9 程宇航;陈宁;;国外一些国家对疫苗是怎样进行监管的[J];老区建设;2018年15期
10 吴科颖;;儿童流感疫苗接种干预在疾病预防中的应用价值研究[J];世界最新医学信息文摘;2016年79期
相关会议论文 前10条
1 朱珊;方宇;常捷;余家乐;张愉;计文婧;杨世民;;西安市家长对儿童疫苗接种信心及影响因素调查[A];2018年中国药学会药事管理专业委员会年会暨学术研讨会论文集[C];2018年
2 ;疫苗守护生命 第三章 疫苗的能与不能 第一节 接种疫苗安全有效[A];科技民生报告丛书——疫苗守护生命[C];2018年
3 ;疫苗守护生命 附录 疫苗接种之“你问我答” 第一问 疫苗问答之“接种疫苗,你知道吗?”[A];科技民生报告丛书——疫苗守护生命[C];2018年
4 杨锡强;;疫苗接种的不良反应及其处理[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年
5 万朝敏;;疫苗接种在流感大流行群体防控中的作用[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年
6 刘柏林;熊亚军;唐有智;唐孝富;;合川区适龄儿童卡介疫苗接种成功率调查分析[A];重庆市预防医学会2012年学术年会论文集[C];2012年
7 ;疫苗守护生命 附录 疫苗接种之“你问我答” 第四问 疫苗问答之“关爱特殊疾病人群”[A];科技民生报告丛书——疫苗守护生命[C];2018年
8 ;疫苗守护生命 附录 疫苗接种之“你问我答” 第五问 疫苗问答之“世界这么大,你想去哪儿看看”[A];科技民生报告丛书——疫苗守护生命[C];2018年
9 陈贤希;陈波;;疫苗药品管理与应用存在的问题及对策[A];2013年“全国医院药学（药学服务与实践）学术会议”论文集[C];2013年
10 ;疫苗守护生命 第一章 免疫系统守护人类健康 第三节 接种疫苗的历史[A];科技民生报告丛书——疫苗守护生命[C];2018年
相关重要报纸文章 前10条
1 时本 医生;疫苗接种要指引更需追溯[N];健康报;2019年
2 记者 阮晓莹;广西进一步做好改革和完善疫苗管理体制工作[N];南宁日报;2019年
3 许诺;政策给力国产创新疫苗有望加速上市[N];医药经济报;2019年
4 本报记者 陈燕飞;我国疫苗开启走向世界大门[N];中国医药报;2018年
5 中国科学技术发展战略研究院科技预测与评价研究所副研究员 张俊祥;“十二五”,疫苗产业要“突围”[N];科学时报;2010年
6 本报驻加拿大特约记者 陶短房 本报驻德国特约记者 青木 本报驻日本特约记者 黄文炜 本报记者 白云怡 范凌志;打消“疫苗恐慌”，各国都出重拳[N];环球时报;2018年
7 胡浩;欧美民粹主义再掀反疫苗运动[N];环球时报;2019年
8 国家药品监督管理局信息中心 张s
本文编号：2682297
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2682297.html
