FGF2调节奶牛乳腺分支的分子机理研究

发布时间：2020-05-26 07:31

【摘要】：奶牛的乳腺分支形态发育是完成泌乳功能的基本条件。乳腺分支结构可以通过提高乳腺腺泡组织的数量和分泌功能来提高奶牛乳产量。三维培养可以在体外诱导组织器官分支形态的发生,已经是研究乳腺分支形态普遍使用的方法,在不同组织的三维培养中证实了FGF2可以诱导类器官分支形态发生。但是以往的研究多以小鼠等啮齿类动物为主,并不能代替反刍动物的乳腺分支研究;关于FGF2调节奶牛乳腺分支的分子机理也鲜有报道。本研究利用从青春期奶牛乳腺中提取的类器官,以镶嵌式培养,用FGF2进行处理来建立奶牛乳腺分支培养模型;再利用转录组学,通过GO功能分析找到与FGF2调节奶牛乳腺分支形态发生有关的基因,并通过qPCR加以验证;之后在奶牛乳腺分支培养过程中分别添加PD173074(FGFR1受体抑制剂)、LY-294002(PI3K抑制剂)、U0126(MEK/ERK抑制剂),通过光镜观察各组奶牛乳腺分支形态的变化,利用western blotting检测各组主要信号通路蛋白的表达,利用qPCR技术检测各组与奶牛乳腺分支相关基因的mRNA表达,由此确定FGF2调节奶牛乳腺分支的分子机理。结果如下:1)以镶嵌式培养的青春期奶牛乳腺类器官,在FGF2处理下36 h时镜下即可见分支形态出现;且从36 h开始,FGF2组分支率显著高于对照组(P0.05),表明奶牛乳腺分支培养模型成功建立。2)FGF2调节奶牛乳腺分支的转录组分析结果表明,与对照组比较,共获得4427个差异显著的基因(P0.05)。其中,FGF2组有1718个基因表达量上调,2709个基因表达量下调。KEGG富集分析共有300个PATHWAY,其中包括参与ECM受体相互作用、局部黏着、MAPK信号转导通路和PI3K-AKT信号通路等。GO功能富集分析共有206个差异显著的GO功能条目(P0.05),其中与分支结构的形态发生有关的GO条目富集51个基因;与细胞黏附功能相关的GO条目富集27个基因。在这些基因中随机选取DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2、SPRY2、SMAD4、DDR1、ESRP2、SRC、MMP14、ILK进行qPCR验证,发现与对照组比较,FGF2组的SPRY2、ILK和SMAD4mRNA表达水平显著上调(P0.05)。DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2、DDR1、ESRP2、SRC、MMP14mRNA表达水平显著下调(P0.05)与转录组结果相一致。3)对对照组、FGF2组、FGF2+PD173074组、FGF2+LY-294002组、FGF2+U0126组形态学观察发现,从36 h开始,与对照组比较,FGF2组和FGF2+LY-294002组的分支率显著升高(P0.05);而与对照组比较,FGF2+PD173074组和FGF2+U0126组的分支率差异不显著(P0.05)。Western blotting结果表明,FGF2+PD173074组的p-AKT和p-ERK蛋白表达显著低于FGF2组(P0.05);FGF2+LY-294002组p-AKT蛋白表达显著低于FGF2组(P0.05),p-ERK蛋白表达差异不显著(P0.05);FGF2+U0126组p-AKT的蛋白表达与FGF2组相比差异不显著(P0.05),p-ERK蛋白表达显著低于FGF2组(P0.05)。qPCR结果表明,与对照组相比,FGF2组和FGF2+LY-294002组的DSG3、DSC3、CDH1mRNA表达水平显著降低(P0.05),SPRY2、SLIT2 mRNA表达水平显著上升(P0.05);与对照组相比,FGF2+PD173074组的DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2 mRNA表达水平均无显著差异(P0.05),SPRY2 mRNA表达水平显著下降(P0.05);与对照组相比,FGF2+U0126组的DSG3、DSC3、CDH1、SPRY2、SLIT2 mRNA表达水平均无显著差异(P0.05)。结论:FGF2能使镶嵌在I型胶原中的青春期奶牛乳腺类器官产生分支形态;在此过程中,FGF2与FGFR1受体结合,MAPK作为其下游与乳腺分支有关的信号通路,激活与分支相关基因SPRY2和SLIT2的表达,并降低细胞黏附相关基因DSG3、DSC3、CDH1的表达,从而调节奶牛乳腺分支形态的发生。
【图文】：

出生后,导管,异速生长,基本单位

图 1-1 出生后乳腺发育阶段的描述[7]Fig. 1-1 Depicting the stages of postnatal mammary gland development显快与其他器官，这种异速生长一般会持续 9 个月。在这个阶段上乳腺增大的速率是体率增长的 3.5 倍。导管分支和延伸的基本单位为终末导管小叶（Terminal duct lobular unLU），通过不断穿透基质经行扩展。

生长因子,成纤维细胞生长因子,泌乳,理学硕士

东北农业大学理学硕士学位论文生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、actor，，TGF)、成纤维细胞生长因子（Fibroblast g胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，FG纤维细胞生长因子信号通路与乳腺癌和乳腺发育和泌乳过程中，成纤维细胞生长因子在奶牛，导管上皮细胞和腺泡细胞等[17]。成纤维细胞生形成有缺陷的乳腺分支从而影响泌乳过程[18]。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】