弓形虫自噬相关蛋白TgATG12促进TgATG8在顶质体外膜定位的分子机制研究

发布时间：2020-05-27 22:09

【摘要】：弓形虫病是一种感染率较高的人兽共患寄生虫病,其病原为弓形虫。弓形虫属于顶复门原虫,含有一个与植物和藻类叶绿体同源的质体,称为顶质体。顶质体对于弓形虫的生存有着极其重要的作用。顶质体的丢失会导致弓形虫的死亡。现有研究表明,TgATG8部分定位于弓形虫顶质体外膜。TgATG8以及调控TgATG8酯化的相关基因TgATG4、TgPROP2等基因缺失都会导致TgATG8无法在顶质体外膜定位,进而导致顶质体的丢失,影响弓形虫的生存。在经典自噬发生过程中,ATG5-ATG12-ATG16复合物发挥类似E3泛素连接酶的作用,对于ATG8的酯化发挥至关重要的作用。然而目前TgATG8在顶质体外膜定位的分子机制尚不明确。本研究首先利用CRISPR/Cas9方法将SmFP-Myc插入到TgATG12的N端,构建SmFP-Myc-TgATG12虫株,对TgATG12的亚细胞定位进行分析。然后,同样利用CRISPR/Cas9方法,将生长素诱导降解因子(AID)插入到TgATG12的N端,构建TgATG12条件性敲除虫株,分析TgATG12条件性缺失后对弓形虫顶质体完整性以及对TgATG8在顶质体定位的影响。实验结果表明,TgATG12定位于弓形虫细胞质内,同时在顶质体周围有明显聚集。该基因缺失后导致TgATG8无法发生酯化,进而导致弓形虫顶质体丢失,最终影响弓形虫的生长复制能力。综上所述,本研究利用AID条件性敲除技术对TgATG12调控TgATG8在弓形虫顶质体外膜定位的分子机制进行了初步解析,为进一步研究自噬相关蛋白调控TgATG8在顶质体外膜定位的分子机制奠定基础。
【图文】：

科学院硕士学位论文 第二章 TgATG12 复合物的图 2. 1 pCD-ΔTgATG12 敲除质粒示意图Fig. 2. 1 Schematic structure of TgATG12 knockout plasmid 构建 SmFP-Myc-TgATG12 重组质粒过融合 PCR 将 TgATG12 起始密码子前后各约 1000bp 的同源臂及 SmFP-M插入 pBluescript Ⅱ KS 载体中。同时，，将同源臂中的 gRNA 靶序列进行同表明成功构建 SmFP-Myc-TgATG12 重组质粒。以 SmFP-Myc-TgATG12 重P-Myc-TgATG12 片段，通过琼脂糖凝胶电泳实验证明 SmFP-Myc-TgATG1. 3）。

图 2. 1 pCD-ΔTgATG12 敲除质粒示意图Fig. 2. 1 Schematic structure of TgATG12 knockout plasmidSmFP-Myc-TgATG12 重组质粒CR 将 TgATG12 起始密码子前后各约 1000bp 的同源臂及 SmFluescript Ⅱ KS 载体中。同时，将同源臂中的 gRNA 靶序列进行构建 SmFP-Myc-TgATG12 重组质粒。以 SmFP-Myc-TgATG1gATG12 片段，通过琼脂糖凝胶电泳实验证明 SmFP-Myc-TgA图 2. 2 SmFP-Myc-TgATG12 重组质粒示意图Fig. 2. 2 Schematic of SmFP-Myc-TgATG12 recombinant plasmid
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72

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本文编号：2684214