猪流行性腹泻病毒高增殖Vero细胞选育、分离鉴定及致肠道靶细胞SIEC病理机制研究

发布时间：2020-05-28 04:08

【摘要】：猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由病原体猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的,不同年龄段的猪均可感染,呈现出水样腹泻、呕吐、水肿等临床症状的一种急性肠道传染病。目前PED已在全世界范围内广泛流行,造成大量仔猪的死亡,给猪产业造成重大经济损失。PEDV主要通过粪-口途径进行传播,但最近报道称PEDV也可通过空气进行长距离传播,这意味着PEDV将对世界猪产业构成严重威胁。截止目前,尽管已建立一系列针对PEDV感染的分子生物学检测技术,但尚无针对此类疾病有效疫苗和药物,究其原因主要是因为病毒变异速度快,致病机理不明确,当前可用细胞对PEDV的感染率低,以及部分地区毒株流行情况不详导致不能及时有效的预防和治疗该类疾病。针对此问题,本试验通过有限稀释技术筛选对PEDV感染呈现出高敏感和高产量Vero细胞株;并通过该Vero细胞株分离鉴定我国西北地区暴发的PEDV毒株及特性;利用分离的病毒感染永生化猪小肠黏膜上皮细胞(SIEC),探究PEDV在靶细胞上的致病机理以及SSIEC细胞增殖的PEDV与Vero细胞增殖的PEDV病毒的差异。具体研究内容与获得结果如下:1.采用有限稀释技术制备单克隆Vero细胞株,单克隆细胞扩大培养后经间接免疫荧光技术筛选出感染率最高的细胞株作为母系细胞,重复以上操作,经过三次逐级筛选最终获得4株理想的单克隆细胞株,命名为Vero/G2A8C4、Vero/G2A8D4、Vero/G2A8E7和Vero/G2A8G6。研究发现,1 MOI PEDV感染细胞96 h后,母系细胞感染率仅为15%,Vero/G2A8G6(Vero/G6)单克隆细胞感染率已达到100%;1 MOI PEDV感染120 h后,Vero细胞70~80%已脱落、死亡,而Vero/G6细胞60%以上细胞状态良好,结构完整,表明Vero/G6细胞的耐受能力更强;0.1 MOI PEDV感染后,Vero/G6细胞在24 h时即可检测到阳性细胞,而母系Vero细胞在感染72 h后才检测到阳性细胞,表明在低病毒感染量下,Vero/G6细胞更有利于PEDV病毒的早期诊断。因此Vero/G6细胞将为PEDV的大量增殖、快速诊断、病毒学研究以及疫苗的制备等方面提供有利的生物工具,同时为预防该类疾病的潜在暴发提供了保障。2.从陕西、甘肃、青海、宁夏等西北地区的8个猪场共采集27份有腹泻症状的病死仔猪小肠样品。对肠道及内容物提取病毒RNA,RT-PCR鉴定结果显示,导致该地区仔猪病毒性腹泻的主要病原体为PEDV,感染率高达92.6%,猪的传染性胃肠炎病毒(TGEV)的感染率为18.5%,轮状病毒(RV)的感染率为0。利用Vero/G6细胞分离鉴定西北地区暴发的PEDV,获得6株PEDV分离毒株,该6株病毒均能在Vero/G6细胞上稳定传至40代;种系发育分析显示,5株分离毒株隶属于经典毒株,1株分离毒株为变异毒株;临床症状以及病理变化发现经典毒株NX1和变异毒株SX1对10日龄未断奶仔猪均为强毒株。qRT-PCR检测发现分离毒株能明显提高肠系膜淋巴结中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表达量以此促进小肠绒毛上皮细胞的凋亡。3.选用已成功构建的PEDV靶细胞SSIECs作为试验材料来研究分离毒株NX1感染后宿主细胞的变化。结果显示,NX1感染SSIEC细胞后降低SSIEC细胞中Na~+-K~+-ATPases,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPases酶的活性,抑制SSIEC细胞的增殖,同时也促进SSIEC细胞的凋亡。回归试验显示,SSIEC细胞中增殖的NX1毒株和Vero细胞中增殖的NX1毒株对7日龄未断奶仔猪均为强毒株,仔猪的临床症状,小肠病理变化以及测量数据表明SSIEC细胞中增殖的NX1毒株比在Vero细胞中增殖的NX1毒力高,具体表现在腹泻症状和死亡症状出现早、肠系膜淋巴结肿胀明显、周边毛细血管充血更严重、肠系膜淋巴结中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表达量高。本试验通过感染靶细胞系和宿主动物来揭示PEDV感染的发病机制,为PEDV相关研究提供了准确而有效的数据支持,同时也为该病的防治、疫苗制备以及深入研究提供了理论基础。
【图文】：

冠状病毒,蛋白

图 1-1 冠状病毒的分类Fig. 1-1 Classification of coronavirusesPEDV整个基因组大约28 kb，由5’和3’非翻译区（UTR）以及7个开放阅读框组成（Hofmann and Wyler 1990；Kadoi et al. 2002）。分别是ORF1a、ORF1b、荚膜蛋白（S）、ORF3、囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）以及核蛋白（N）组成, 顺序依次为5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR （ fig. 2 ）（ Chang et al. 2002 ； Cruz et al.2008a；Sun et al. 2007）。ORF1a 和 ORF1b 占据了5’末端三分之二的基因组长度，共编码12个非结构蛋白（Nsp1-7, 9-13），参与病毒的复制过程（Gao et al. 2013；Li et al.2012；Park et al. 2012）。ORF1a和ORF1b编码产生pp1a和pp1bl两种蛋白，该蛋白被蛋白酶水解形成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12（Brian and Baric 2005；Utiger et al. 1995b）。

猪流行性腹泻病毒,基因组

图1-2 猪流行性腹泻病毒基因组Fig.1-2 PEDV genome1.3 PEDV 的致病机理PEDV 感染机体后，病毒的增殖主要集中在猪的小肠绒毛上皮细胞（十二指肠、空肠和回肠）（Debouck et al. 1981；Ducatelle et al. 1982），感染后引起猪肠道上皮细胞的破坏、绒毛缩短、绒毛上皮细胞消化吸收功能降低、最终引起机体腹泻、持续时间大约 1 个星期，其它临床症状包括呕吐、厌食、消瘦和死亡等（Duarte and Laude1994；Park et al. 2011a）。PEDV 可以感染所有年龄段的猪群，但是出生不到一星期的未断奶仔猪感染率最高，临床症状和病理变化也最为严重。断奶仔猪的死亡率最低，，大约为 1～3%，到目前为止尚没有育肥猪感染死亡的报道（Hou et al. 2007；Park et al.2007a；Sun et al. 2008）。先前报道称 PEDV 仅在肠道内部增殖，但是最近的一项研究发现
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

【参考文献】