IFITM1基因在小鼠卵泡发育与排卵过程中的功能及相关调控机制研究

发布时间：2020-05-28 06:47

【摘要】：从卵泡发育到排卵需经过十分复杂的生理过程,此过程受内分泌激素、免疫调节和代谢信号等多种复杂因素共同调节。目前其相关过程的分子机制研究仍然比较有限。课题组前期对大白猪和太湖猪的排卵前卵泡组织进行了转录组测序,鉴定出2675个差异表达的基因。其中干扰素诱导的跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)在两个猪种间表达差异极显著,差异表达倍数为3.174。故本研究以IFITM1基因为研究对象,以小鼠卵巢颗粒细胞为研究模型,利用RNAi和超表达等方法,通过细胞原代培养、转染、qRT-PCR、Western blot、ELISA、EDU染色、MTT实验、CCK-8实验和流式细胞术等技术,研究IFITM1基因在卵泡发育与排卵中的功能及相关分子调控机制。主要研究结果如下:1.IFITM1基因在卵泡排卵过程中的作用(1)IFITM1基因影响排卵标记基因表达及分子机制在小鼠卵巢颗粒细胞(mouse granulosa cells,mGCs)中,通过qRT-PCR和Western blot等方法表明干扰IFITM1基因的表达可以显著促进排卵标记基因LHR、AREG、EREG和Cyp19a1的表达;补偿实验表明,过表达IFITM1基因能显著抑制排卵标记基因LHR和Cyp19a1的表达。在mGCs中,加入3种调控卵泡发育或排卵的重要细胞信号通路(ERK1/2、TGF-β和PI3K/AKT)的抑制剂阻断相应的细胞信号通路后检测排卵相关标记基因。qRT-PCR结果显示,阻断ERK1/2或TGF-β细胞信号通路后抑制表达IFITM1基因,排卵标记基因EREG、LHR的mRNA水平仍有显著上升;阻断PI3K/AKT信号通路后抑制表达IFITM1基因,排卵标记基因LHR、Cyp19a1和EREG的mRNA水平则未出现明显改变。同时Western blot结果显示,抑制表达IFITM1基因后,PI3K/AKT信号通路上关键蛋白p-AKT(Ser473)的蛋白质水平显著降低。以上结果表明,IFITM1基因通过PI3K/AKT细胞信号通路活性影响排卵标记基因的表达。(2)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮在mGCs中,超表达或抑制表达IFITM1基因后运用qRT-PCR方法检测孕酮及其受体合成关键基因的表达水平。结果显示,超表达IFITM1基因,孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著升高;抑制表达IFITM1基因,孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著降低,孕酮合成关键基因3β-HSD,StAR mRNA表达水平显著升高。在mGCs中,转染pCMV-HA-IFITM1或siRNA-IFITM1后运用ELISA方法检测细胞上清中的孕酮的浓度,结果表明:超表达IFITM1基因,孕酮的浓度未出现明显变化,抑制表达IFITM1基因,显著降低孕酮的浓度。以上结果表明,IFITM1基因能影响小鼠卵巢颗粒细胞分泌孕酮,并影响颗粒细胞孕酮受体的合成。2.IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞周期与细胞增殖通过流式细胞术检测IFITM1基因对卵巢颗粒细胞周期的影响,结果显示,相比于对照组,超表达IFITM1基因后,卵巢颗粒细胞周期S期细胞比例显著降低,抑制表达IFITM1基因,卵巢颗粒细胞周期G0/G1期的细胞比例显著降低。qRT-PCR结果显示,超表达IFITM1基因,细胞周期蛋白CCNA2和CCND1 mRNA的表达水平显著升高;抑制表达IFITM1基因,CCND1的mRNA水平显著降低。在颗粒细胞中,运用EDU染色实验、CCK-8实验和MTT实验来检测细胞增殖的变化。实验结果显示:与对照组相比,IFITM1的表达受到抑制,颗粒细胞增殖的比例显著降低。综上所述,得出结论:(1)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮,并通过影响PI3K/AKT信号通路活性影响卵泡排卵;(2)IFITM1基因通过调控细胞周期调控因子CCND1的表达影响卵巢颗粒细胞周期;IFITM1基因能调节卵巢颗粒细胞增殖。
【图文】：

过程图,卵泡发育,过程,卵泡

课题组前期通过对大白猪和太湖猪的排卵前卵泡组织进行转录组测序5 个差异表达的基因。其中干扰素诱导的跨膜蛋白 1（IFITM1）在两猪极显著，差异表达倍数为 3.174。本研究以 IFITM1 基因为研究对象，粒细胞中探究 IFITM1泡发育和排卵过程及其调控卵过程是指卵巢中成熟卵泡的破裂和可受精卵母细胞的释放。进一步细胞恢复减数分裂、卵泡破裂、卵巢颗粒细胞重构及黄体细胞的形成等利发育至排卵前卵泡是排卵发生的必要条件。卵泡发育则是指原始卵成熟卵泡并排卵的生理过程（图 1-1）。卵泡主要由卵母细胞、颗粒细成，三种细胞之间相互作用保证了卵泡的顺利发育。

功能图,干扰素诱导,跨膜蛋白,功能

IFITM1 基因在小鼠卵泡发育与排卵过程中的功能及相关调控机制研究制病毒粒子进入胞质。在细胞因子方面：IFITM3 是干扰素应答的负调节因子，它能加速自噬体中 IRF3 的转换。IFITM3 也能抑制促炎细胞因子 IL-6 的产生，，IL-6 可以诱导 IFITM 基因的表达。相比之下，IFITM2 能通过与 BAG3 的细胞表面受体互作来促进 IL-6 的上调表达。在细胞迁移和入侵过程中：IFITM3 与 Src，FAK 和 Ambra1等多种蛋白质发生互作，能调节细胞粘附和运动。IFITM3 协助粘着点和自噬体之间的 Src 亚细胞运输。从细胞增殖和细胞周期调控方面来看，干扰素通过 STAT 信号负调节细胞分裂和生长，其中 IFITM 蛋白作为下游效应蛋白。IFITM1 与小窝蛋白-1（CAV-1）互作后能抑制ERK/MAPK信号传导，该信号是刺激细胞增殖的关键途径。同时，IFITM1 能增强肿瘤抑制因子 p53 的蛋白稳定性。综上所述，IFITM 蛋白能影响对免疫力有直接和间接影响的各种细胞过程（图 1-3）(Lange et al 2003)。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S813.1

【参考文献】