不同毒力G蛋白狂犬病重组病毒的拯救及生物学特性研究

发布时间：2020-05-30 20:19

【摘要】：本课题研究以狂犬病病毒疫苗毒LBNSE株的反向遗传学系统为骨架,分别用RT-PCR扩增CVS-11株(标准攻击毒株)与SAD株(疫苗毒株)的G基因,将该基因分别与pLBNSE质粒中的的G基因进行替换,构建两株重组质粒。利用反向遗传学系统拯救出两株重组不同毒力狂犬病G蛋白的重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG,然后对两株病毒的生物学特性进行探究。应用Overlap PCR的方法,利用Snapgene生物学软件设计引物,对实验室保存的全长pLBNSE质粒的Pst I和EcoR I酶切位点进行改造,改造后质粒命名为r-pLBNSE。根据GenBank上发表的SAD株和CVS11株的全基因序列,利用Primer5生物学软件分别设计G基因引物(G基因前加信号肽和flag标签),分别进行RT-PCR扩增出SAD株和CVS11株的G基因序列。将扩增出的G基因序列,经酶切、连接等步骤替换到改造后的r-pLBNSE质粒上,构建出重组G基因的全长质粒并命名为r-pLBNSE-SfG(带 flag 标签的 SAD 株 G 基因)和 r-pLBNSE-CfG(带 flag 标签的 CVS11株G基因)。利用反向遗传学系统,将重组全长质粒与辅助质粒pH-N、pH-P、pH-G和pH-L共转染BSR细胞,拯救出重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG。应用直接免疫荧光和RT-PCR的方法鉴定拯救的重组病毒。通过探究两株重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的生物学特性,发现重组病毒的生长特性与亲本毒株相一致,通过对糖蛋白表达量的比较发现重组病毒糖蛋白表达量明显低于亲本毒株,而致病性由强到弱依次为rLBNSE-CfG≥rLBNSE-SfG≥LBNSE。本实验为探究狂犬病的致病机理、病毒的包装、运输、释放及病毒的神经嗜性与糖蛋白的关系等机制的研究奠定基础。
【图文】：

图２狂犬病病毒结构模型逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｒａｂｉｅｓ邋ｖｉｍｓ逡逑

图３全长克隆质粒的改造策略逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｔｈｅ邋ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｎｅｗ邋ｆｌｉｌｌ邋ｃｌｏｎｅ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ逡逑
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.655

【参考文献】

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本文编号：2688667