木犀草素对LPS诱导的IEC-6细胞损伤的保护机制及其在杨树花中提取与富集工艺的研究

发布时间：2020-05-30 19:42

【摘要】：木犀草素是一类广泛存在于植物界的天然黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗菌、降血脂血压、保护神经系统及提高免疫力等多种药理功效,且可以保护细胞及组织免受损伤,但其作用机制尚不清楚。本研究应用CCK8法测定IEC-6细胞活力,并应用Real-time PCR、Western blot、ELISA等分子生物学技术来测定木犀草素对IEC-6细胞中TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α的基因与蛋白表达水平,从TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的角度探讨木犀草素对LPS(lipopolysaccharides)诱导IEC-6细胞损伤模型的保护机制。同时,在单因素试验基础上,应用响应面法设计并优化杨树花中木犀草素的超声提取工艺,并采用大孔树脂法对杨树花中木犀草素富集工艺进行了优化。研究结果如下:1.与对照组相比,0.1、0.5、1.0μg/mL木犀草素组IEC-6细胞生存率均无明显差异(p0.05),而2.0μg/mL木犀草素组IEC-6细胞生存率显著下降(p0.05),因此将木犀草素浓度设定为0.1、0.5、1.0μg/mL。与对照组相比,0.1与0.5μg/mL LPS组IEC-6细胞生存率无显著差异(p0.05),而1.0和2.0μg/mL LPS组IEC-6细胞的生存率显著降低(p0.05),因此,取1.0μg/mL LPS对细胞进行损伤处理。与LPS组相比,0.5和1.0μg/mL木犀草素显著提高LPS诱导的IEC-6细胞的生存率(p0.05);与空白组相比,LPS组IEC-6细胞的IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88与NF-κb mRNA及蛋白水平均出现不同程度的上调(p0.05);而与LPS组相比,0.1、0.5与1.0μg/mL木犀草素组IEC-6细胞的IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88与NF-κb的mRNA及蛋白水平显著下调(p0.05)。2.本试验利用Box-Behnken模型优化杨树花中木犀草素的超声提取工艺,应用响应面法评价木犀草素最优提取条件,以二次多项式模型与响应曲面图分别描述木犀草素的提取过程与变量影响提取率,根据以上结果得到的最佳提取参数是:乙醇浓度为63%,提取温度为68~?C,粒径为0.18-0.25 mm,提取时间为42 min,液料比为25 mL/g,超声强度68.12 W/cm~2,提取2次。3.在基于超声提取优化工艺的结果基础上,研究了十二种大孔树脂对木犀草素的富集工艺;静态吸附试验结果显示树脂SP-825最为适用,其数据符合Langmuir和Freundlich等温线;为了获得最佳的分离过程,进一步研究了上样速率、上样量与解吸液浓度等因素条件;最终优化吸附条件为:木犀草素上样浓度16.48μg/ml、pH 5.0、上样量10 BV、流速2 BV/h、温度25~?C;解吸条件为:蒸馏水洗脱5 BV、20%乙醇洗脱5 BV、50%乙醇洗脱5 BV、流速2 BV/h。本试验的结果说明,木犀草素能够保护LPS诱导的IEC-6细胞的活力,下调TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α的基因与蛋白表达水平,从调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的角度揭示了木犀草素保护肠黏膜屏障的机制。同时,本研究采用响应面法优化了杨树花中木犀草素的超声提取工艺,将其提取率提高至8.89±0.34 mg/g;并应用大孔吸附树脂法优化了木犀草素的富集工艺,将其含量提高了3.67倍,此结果在天然药物的提取与分离方面具有理论意义和实用价值。
【图文】：

木犀草素,分子结构式

、金银花与荆芥等[50]。木犀草素具有广泛的药理作用，其血脂血压、抗过敏、抗惊厥、提高免疫力等多重功效，可临床具有解痉、利胆、消炎及保肝等功效，，多用于治疗心草素能够抑制包括枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，该抑制效果越显著[54]。木犀草素的功能之一是可以有效地阻碍了组胺的释放，从而调控酪氨酸蛋白酶、丝氨酸-苏氨犀草素可将氢原子提供给自由基，因此木犀草素在某些特氧化能力[56]。有相关研究表明，木犀草素是多靶点抗肿瘤与诱导过程，或者使细胞趋于凋亡状态，由此可见，木犀药物[57]。相关研究人员用不同浓度木犀草素干预心肌细胞定浓度的木犀草素能够使 SOD 活性增强，保护 H202诱导表明木犀草素具有保护机体心血管的功能[58]。

木犀草素,IEC-6细胞,活力,细胞的

果与分析犀草素对 LPS 诱导的 IEC-6 细胞的保护作用及分子机木犀草素与 LPS 对 IEC-6 细胞活力的影响图 3-1（A）所示，与对照组比较，0.1、0.5 和 1.0 μg/mL 的木犀草素对 IEC-6用。如图 3-1（B）所示，与对照组比较，0.1、0.5 μg/mL LPS 组 IEC-6 细胞的差异，但 1.0 与 2.0 μg/mL LPS 对 IEC-6 细胞的生存率具有抑制作用，因此 L定为 1.0 μg/mL。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.7

【参考文献】