奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价

发布时间：2020-05-31 12:06

【摘要】：随着乳制品消费水平的不断提高,人们越来越关注牛奶的质量。奶牛乳腺炎已经成为严重影响牛乳品质的重要因素,抗生素是比较有效的治疗手段,但抗生素带来的负效应日益凸显,病原菌耐药性增强、牛乳中抗生素残留等众多问题,导致奶牛产奶量降低和生乳品质下降。因此,研发新型可替代抗生素的产品,对于提升牧场经济效益、提高牛乳品质具有重大意义。本研究通过RT-PCR、同源重组等技术构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)/气管抗菌肽基因(TAP)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。将上述质粒转染到奶牛的原代乳腺上皮细胞和泌乳高峰期的小鼠中,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白,荧光定量PCR和Western Blot检测技术验证上述质粒在乳腺上皮细胞水平和乳腺组织水平的特异性表达。通过细胞功毒实验分析表达产物抗菌效果,通过小鼠负重实验、耐缺氧实验、体重变化称量、血液生化指标和脏器指数评估重组质粒的安全性。旨在通过重组质粒实现奶牛溶菌酶、气管抗菌肽内源抗菌物质在乳腺组织的特异性表达,提高奶牛自身的免疫力,以达到防治乳腺炎和提高原料奶质量的目的。主要研究结果如下:1治疗奶牛乳腺炎表达质粒的构建通过RT-PCR从牛乳腺上皮细胞扩增Lyz、TAP基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中,利用同源重组技术,以奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子替换pEGFP-N1载体原有CMV启动子,构建了奶牛溶菌酶基因(Lyz)/气管抗菌肽基因(TAP)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。琼脂糖凝胶电泳结果显示,奶牛溶菌酶基因(LLz)、气管抗菌肽基因(TAP)和β-乳球蛋白基因(BLG)启动子序列,PCR扩增出与预期片段长度匹配的条带,且菌液PCR检测显示,每个目的片段均连接到增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中的所需位置。BLG基因启动子克隆测序后,通过BLAST比对发现,克隆的启动子序列与数据库中该基因5'上游相似性达99%。分析该片段,分别在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的启动子元件,表明所选片段为BLG基因的启动子片段。重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP测序结果显示与目的片段长度相符,目的基因阅读框正确,未出现错误位置。2重组质粒细胞表达活性及抗菌效果采用脂质体转染法将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP分别转染至奶牛原代乳腺上皮细胞(bPMEC)和人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜观察到只有奶牛原代乳腺上皮细胞在转染两种重组质粒后均表现出绿色荧光,人肾脏上皮细胞无显色。荧光定量PCR检测也表明两种重组质粒只有在转染至奶牛原代乳腺上皮细胞后,基因Lyz、TAP相对表达量极显著高于未转染空白对照组,在人肾脏上皮细胞中无表达。用重组质粒转染的原代乳腺上皮细胞感染金黄色葡萄球菌后,细胞存活率显著高于未转染重组质粒的对照组,与未感染金黄色葡萄球菌、未转染重组质粒的空白组对比没有显著差异。细胞死亡率极显著低于对照组(P0.01)。3重组质粒小鼠乳腺的表达和安全性评价通过尾静脉注射法使用基因体外转染试剂,将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP转染至处于泌乳高峰期的小鼠体内,荧光定量PCR结果显示,小鼠乳腺组织中基因TAP和Lyz的表达水平显著增加。在小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中未检测到靶基因的表达。Western Blot检测显示,在转染重组质粒的小鼠乳腺组织中检测到重组质粒绿色荧光蛋白基因EGFP所表达的蛋白质产物,在未用重组质粒转染的小鼠乳腺组织中未检测到该表达产物。对小鼠的各种生理生化指标进行检测表明,发现重组质粒对小鼠行为活动指标、质量变化、血液生化指标、脏器指数无显著影响。本研究制备了两种新型乳腺特异性表达质粒,并验证了细胞水平、活体水平的表达情况和抗菌效果,为未来该质粒应用于奶牛乳腺炎的防治奠定了一定的基础,为奶牛乳腺炎的防治提供了新思路、新方法,为奶牛溶菌酶、奶牛气管抗菌肽在奶牛乳腺中特异性表达、研发新型可替代抗生素产品提供重要理论依据和技术支持。
【图文】：

示意图,溶菌,溶菌酶,细菌细胞

鹏奶牛溶菌酶基因（Ｌｙｚ）和气管抗菌肽基因（ＴＡＰ）表徸质粒的构建、抗菌效果及安全具有抗菌、消炎、组织修复及提高免疫力等多方面的功能？。根据溶菌酶的生用机理，溶菌酶可分为四类：噻菌体Ｔ４溶菌酶（ｐｈａｇｅ－ｔｙｐｅ）、植物源溶菌酶（ｅ）邋、邋微生物溶菌酶邋（邋ｂａｃｔｅｒｉａ－ｔｙｐｅ）邋和动物源溶菌酶。邋动物来源的溶菌酶是最丰富的溶菌酶，包括溶菌酶邋ｃ邋型（ｃｈｉｃｋｅｎｔｙｐｅ）、ｇ邋型（ｇｏｏｓｅ－ｔｙｐｅ）和邋ｉ邋型（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ－ｔｙＥｎｚｙｍｅ邋ｄｉｓｔｏｒｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｕｇａｒ邋ｉｎ邋ｓｉｔｅ邋Ｄ逡逑ｍａｋｉｎＩｔ邋ｕｎｓｔａｂｌｅａｏｗｎ

牛胃,溶菌酶,晶体结构

酶在皱胃中消化分解细菌，消化成分被小肠吸收。该机制可有效的运行源于消化型溶菌酶逡逑能抗胃蛋白酶（ｐｅｐｓｉｎ）的消化拆解，使其在酸性ｐＨ环境中具有最佳活性。牛胃溶菌酶（ＢＳＬ２）逡逑在酸性环境中具有高构象稳定性，牛胃溶菌酶晶体结构如图２所示，牛胃溶菌酶分子由ａ逡逑结构域和Ｐ结构域组成。四个ａ螺旋（Ａ－Ｄ）组成一个ａ结构域。大环和三个ｐ折叠形成的逡逑反平行Ｐ股最终组成了邋Ｐ结构域。由ＢＳＬ２晶体结构可知，带负电荷的表面、缩短的大环逡逑和盐桥可以保证结构的稳定性，因此抵抗胃蛋白酶［４°］。逡逑Ｇ－ｈｅｌｉｘ逡逑ｆｉ，，邋＾逦＜逦，逡逑ｌ．邋／邋ｐ－ｔｅｉｔｎｉｎｕｓ逡逑Ｄ－ｈｅｌｉｘ逦，逡逑Ｓ＼邋Ａ－ｈｅｌｂ逡逑ａ—ｄｏｍａｉｎ逦＼逦｜逡逑．逡逑Ｃ—ｌｅｒｍｉｉｕｉｓ逡逑图２牛胃溶菌酶ＢＳＬ２晶体结构［４°］逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｓｔｏｍａｃｈｌｙｓｏｚｙｍｅ邋２邋（ＢＳＬ２）逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S858.23

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