牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ7菌株生物学特性及比较基因组学研究

发布时间：2020-05-31 19:07

【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)拥有5种荚膜血清型(A、B、D、E和F),不同血清型的菌株与宿主适应性有关,其中A型菌株主要引起禽霍乱和牛船运热,B型菌株主要引起出血性败血症。禽霍乱主要感染途径为呼吸道,有从高死亡率为特征的急性/急性全身性疾病到相对温和的慢性局部感染等多种表现形式。船运热主要是由牛运输过程中的应激反应所诱发,主要表现为发热、呼吸困难、渗出性和坏死性肺炎。本实验室前期研究发现,在A型Pm中,禽源菌株PmQ能同时感染雏鸡和小鼠,而以PmCQ2(分离自牛肺炎)为代表的多数牛源菌株仅能感染小鼠等哺乳动物,却不能感染雏鸡;但分离自牛肺炎的A型菌株PmCQ7,既可以感染小鼠,又可感染雏鸡并致死,通过RIRDC MLST分型发现该菌株与其它牛源A型菌株分属不同的MLST型。为了进一步确定PmCQ7的分类地位及其宿主源性,本研究比较分析了PmCQ7与牛源和禽源A型Pm的生物学特性及遗传进化关系,在此基础上以外膜蛋白为靶标研究了PmCQ7的适应性突变,并比较分析了PmCQ7和禽源菌株的特异性基因及假基因情况,以期为Pm致病机制和跨宿主感染研究奠定基础。结果如下:1.PmCQ7生物学特性研究本试验对27株Pm进行RIRDC MLST分型和LPS基因型鉴定,发现牛源A型菌株(包括PmCQ7)LPS基因型均为L3型,B型为L2型,禽源Pm均为L1型。除PmCQ7(ST7)和PmCQ3(与ST79相比仅pgi发生单碱基突变)外,所有牛源A型Pm均为ST79,B型(PmB)和F型(PmF)菌株分别为ST122和ST9;两株禽源菌株sPL665和PmQ分别为ST342和ST129。基于电导率的生长曲线显示,PmCQ7和PmQ在37℃和41.5℃有相似的电导率变化,而PmCQ2菌株在37℃的电导率明显大于41.5℃。基于细菌计数的生长曲线发现,PmCQ7和PmQ在培养基中的生长速度和抗逆性均快于或强于PmCQ2。结果提示,在41.5℃(禽体温)条件下,PmCQ7和PmQ有较快的生长速度和较强的抗逆性,但该温度会抑制PmCQ2的生长。生化试验结果显示,牛源菌株(PmCQ2、PmCQ5、PmCQ6)和PmCQ7对葡萄糖、蔗糖、木糖和山梨醇呈阳性反应,禽源菌株PmQ均呈阴性反应;而禽源菌株sPL665对前两者呈阳性反应,对后两者呈阴性反应。通过KM小鼠和雏鸡的致病性试验发现,不同宿主来源的Pm致病性存在差异。禽源菌株sPL665和PmQ以及PmCQ7的致病性明显强于牛源菌株,且牛源菌株PmCQ2不对雏鸡致死。进一步通过细菌定殖试验发现,PmCQ7和PmQ在KM小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中的定殖量高于PmCQ2。结果提示,PmCQ7和PmQ的高定殖量可能是致病性强于PmCQ2的原因之一。2.PmCQ7菌株全基因组测序采用全基因组鸟枪法(Whole Genome Shotgun,WGS)对PmCQ7进行全基因组测序。结果显示,PmCQ7基因组不携带质粒,只包含一条环状的染色体。基因组全长为2243276bp,GC含量为40.41%。PmCQ7有2112个功能基因,包括2036个CDSs(Coding sequences)和76个RNA。基因组特征分析发现,PmCQ7基因组包含2个CRISPRs序列、2个非完整的噬菌体、3个基因岛、60个碳水化合物活性酶相关基因、至少44个毒力相关基因及43个抗生素相关基因。亚细胞定位分析发现,PmCQ7菌株编码172个含信号肽的蛋白和512个含跨膜结构的膜蛋白。3.PmCQ7与其它Pm的系统进化关系对39株A型Pm进行了基因组平均核苷酸一致性(ANI)分析和基于Multi-host MLST、RIRDC MLST、核心基因组SNPs和54个外膜蛋白的聚类分析发现,PmCQ7与其它牛源A型菌株没有明显的聚类关系,却与禽源菌株有更近的系统发育关系。进一步基于OmpA和OmpH1的聚类分析发现,PmCQ7聚类于牛源菌株分支。结果提示,PmCQ7来源于禽类,在跨宿主转移后OmpA和OmpH1已发生适应性突变。多种进化关系分析结果还显示,禽源菌株分布于多个分支,而牛源A型菌株主要聚于一个分支。结果提示,禽源菌株呈遗传多样性,但牛源菌株呈遗传单一性。4.基因组组成和共线性分析通过非必需基因组binary abscent/present值分析基因组组成发现,PmCQ7非必需基因组的组成与禽源菌株类似。但通过基因组共线性分析发现,PmCQ7与牛菌株在基因株水平上的共线性几乎一致。分析共线区之间的序列发现,转录tRNA和rRNA的DNA序列常出现在两个共线区之间。结果提示,转录RNA的序列可能在基因组重排中发挥重要的作用。5.宿主特异性基因和假基因分析以蛋白序列相似性80%为阈值,未发现PmCQ7和禽源菌株间共有的宿主特异性基因。进一步分析发现,牛源菌株或部分菌株核心基因组有4个基因断裂,形成假基因,它们分别编码是嘧啶/嘌呤透化酶、nutA同源蛋白(UDP-糖水解酶和5'-核酸酶双重酶活性)、TonB依赖性受体和O-抗原连接酶。前三者的失活可能降低代谢效率或营养物质的摄取,进而降低牛源菌株的生长和增殖速度。由于Pm脂多糖不含O-抗原,推测编码O-抗原连接酶基因的断裂可能不影响牛源菌株脂多糖的合成。
【图文】：

荚膜,基因簇,相关疾病

图 1.1 5 种 Pm 荚膜血清群（A、B、D、E 和 F）region 2 基因簇FIG 1.1 Genetic organization of region 2 of the capsule biosynthetic loci of the five P. multocidacapsular serogroups (serogroups A, B, D, E, and F)[7].表 1.1 Pm 引起的相关疾病Table 1.1 Disease syndromes caused by Pasteurella multocida[14].Disease Capsular serogroup Species affecte Virulence factorsAnimal bite-associatedsepsisUsually notdetermined, butwhere given usuallyA, occasionally DAny, but mostcommonly humans,cats, dogsNot establishedHaemorrhagicsepticaemiaB, E Cattle, buffalo, pigs,goats, deer, camels,rarely horsesCapsule, fimbriae,filamentous haemagglutininAvian cholera A, F, very rarely D Chickens,turkeys,ducks,wildbirdsCapsule, LPS, iron acquisitionproteins, fimbriae, filamentoushaemagglutinin, sialic aciduptakeAtrophic rhinitis D, rarely A Pigs, rabbits Pasteurella multocida toxin(PMT)

外核,寡糖,调控基因,化学结构

第 1 章文献综述要的基因型为 L3 和 L6，分别占 32.1%(18/56)和 66.1%(37/56)； L3 和 L6，分别为 76.5%(13/17)和 23.5%(4/17)。在所有的 109 株因型为 L1、L2、L3 和 L6，分别占 9.2%(10/109) 、12.8% (14/109) 38.5% (42/109)[37]。说明 LPS 基因型在与宿主存在一定的联系。 LPS 外核心寡糖 PEtn 基团的抗 LPS 血清[30]，以及 L3 与 L6 外主成份逃避宿主的免疫系统有关[3, 31, 34]。虽然不清楚 L1 型 LPS 源 Pm 流行率这么高，，提示 L1 型 LPS 可能在抵抗宿主或促感染3]。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

【参考文献】