O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断CLIA方法的建立

发布时间：2020-05-31 19:20

【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄类动物共患的烈性传染疫病,对家畜养殖业和国际间的活畜贸易有着巨大威胁。针对口蹄疫病毒抗体进行检测是口蹄疫疫情监测的主要手段之一,其中液相阻断ELISA(liquid-phase blocking ELISA,LPB-ELISA)是O型口蹄疫病毒抗体检测中重要方法,被广泛应用于疫苗评价和动物检疫中,但其存在检测通量低,耗时耗力等缺点。本试验开发了O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断CLIA方法(liquid-phase blocking CLIA,LPB-CLIA),在保留检测准确性的同时将检测通量提高了5-10倍,并对检测稳定性做出了优化,为我国口蹄疫防治提供了更经济高效的检测方法。减少血清稀释倍数是提高检测通量的关键因素,为了确定试验最佳血清稀释倍数,在不同稀释倍数下对不同效价的8份血清进行检测,考察各稀释倍数的有效检测范围。结果表明,所有稀释倍数下检测范围均在3-5个滴度内。因此,为了保证检测准确性和检测通量的最优化,将血清分为高效价血清(效价大于等于1:128)和低效价血清(效价小于1:128)分别确定最佳稀释倍数。通过90份低效价血清和54份高效价血清的检测,确定8倍稀释为低效价血清最佳稀释倍数,64倍稀释为高效价血清最佳稀释倍数。为了对检测结果做出有效且有意义的解释,本研究通过检测大量血清,计算其抑制百分率(Percentage Inhibition,PI),并利用PI值的ROC曲线分析确定各效价血清间最佳临界值,从而建立起PI值与效价的对应关系,实现对检测血清的准确赋值。最终对两个检测体系建立了各自的结果判断标准,并对交叉部分(效价1:90及1:180)进行了验证,结果表明88份血清中79份血清检测结果一致,而9份异常血清中8倍检测结果符合更好,因此,确定对于交叉部分血清以8倍稀释检测结果为准。确定整个检测体系后,对试验的重复性、敏感性和特异性进行了验证。结果表明试验PI值的批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,45份血清3次检测效价平均标准差为0.03,具有很好的可重复性。通过检测214份O型口蹄疫阳性血清和246份O型口蹄疫阴性血清,试验敏感性为98.5%、特异性为96.3%。检测37份A型口蹄疫阳性血清和7份Asia I型阳性血清,均为阴性结果,表明试验无交叉反应性。比较239份血清LPB-ELISA和LPB-CLIA的检测结果,显示两种方法的相关系数为0.95,属于高度相关。最后应用本试验对6株不同的疫苗免疫效果进行了跟踪评价,结果表明本试验检测的免疫动物抗体消长血清与LPB-ELISA检测结果基本一致,可用于对疫苗质量的评价和疫苗免疫程序的制定。本试验建立的O型口蹄疫抗体高通量液相阻断CLIA检测方法,可实现单一稀释倍数定性检测和双稀释倍数定量检测,大幅提高了检测通量和检测效率,同时又保留了LPBELISA检测的准确性,可为口蹄疫大批量诊断提供更好的选择。
【图文】：

口蹄疫,爆发事件,口蹄疫病毒

综上所述可知，全球口蹄疫疫情不断，距离彻底控制和消灭口蹄疫需要更为有效的防控手段。图1-1 口蹄疫流行圈及2007年到2014年口蹄疫爆发事件[11]Fig.1-1 FMDV Pools and major highlight of FMDV events from 2007 to 20141.2 口蹄疫病毒口蹄疫病毒属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，共有O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT 3型7个血清型，每个型内可分为众多亚型。完整的FMDV粒子由单股正链RNA和4个结构蛋白组成，，呈二十面体结构。FMDV基因全长8.5kb，可分为5’非编码区（5’UTR）、编码区（ORF）、3’非编码区（3’UTR）和polyA。5’UTR含有5个功能区，分别为S片段、polyC、伪节点、顺势作用元件和内部核糖体进入位点（Internalribosomeentrysite，IRES），帮助病毒的复制和转录顺利进行。3’UTR可结合大量复制过程所需蛋白

基因结构,抗原位点

第一章绪论点所在，在O型FMDV中已发现有5个不同功能的抗原位点，其中VP1中含位点，G-H环和羧基段，是FMDV形成抗原免疫原性最重要的蛋白[17]。目通过外源表达VP1等抗原位点来制备口蹄疫疫苗[18, 19]。因此，对FMDV的理的深入研究可为FMD诊断技术开发和疫苗研制提供坚实的理论基础和路。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.3

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