猪肺炎支原体疫苗候选蛋白的筛选

发布时间：2020-06-01 08:56

【摘要】：猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染引起的一种以咳嗽、气喘为主要症状的慢性、消耗性呼吸道传染病,给全世界养猪业带来了重大的经济损失。现阶段大部分猪场使用Mhp灭活疫苗,还有部分猪场使用弱毒疫苗来控制MPS,但存在免疫效果不佳、价格高昂、使用不便等问题,因而研发高免疫保护力且便于使用的疫苗对于防控该病具有重要的意义。1鉴定猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白ELISA方法的建立Mhp366是一种能够在Mhp自然感染条件下刺激宿主产生强烈体液免疫的蛋白,能与Mhp恢复期血清发生强烈反应,而不与Mhp灭活疫苗高免血清发生反应。将pGEX-6P-1-mhp366重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),构建重组菌GST-Mhp366,诱导表达Mhp366蛋白。将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被,分别与11份Mhp恢复期血清和7份Mhp阴性血清反应,通过对抗原包被量、封闭液条件、血清(Mhp恢复期血清和Mhp阴性血清)和二抗稀释度进行优化,最终确定GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液原液为抗原的最佳包被浓度,PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉为最佳封闭液,分别将血清按照1:500稀释、HRP标记兔抗猪IgG酶标二抗按照1:40 000稀释为最佳血清和二抗工作浓度,从而建立了鉴定猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白的ELISA方法。2猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白的筛选鉴定利用生物信息学方法筛选到20个普遍存在于Mhp菌株中的保守蛋白:Mhp153、Mhp156、Mhp228、Mhp252、Mhp265、Mhp322、Mhp336、Mhp351、Mhp364、Mhp379、Mhp390、Mhp424、Mhp472、Mhp483、Mhp504、Mhp511、Mhp535、Mhp623、Mhp677和Mhp682。这些蛋白对应的基因连接p GEX-6P-1载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)/XL-1 Blue,诱导表达目的蛋白。用诱导表达目的蛋白的20个重组菌裂解液和GST工程菌裂解液原液包被谷胱甘肽板,PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉封闭,分别将血清(11份Mhp恢复期血清和7份Mhp阴性血清)按照1:500稀释、HRP标记兔抗猪IgG酶标二抗按照1:40 000稀释,进行ELISA反应。共筛选出10个Mhp血清体液免疫显性蛋白,分别为Mhp153、Mhp156、Mhp336、Mhp364、Mhp379、Mhp424、Mhp472、Mhp535、Mhp623和Mhp677。3鉴定区分猪肺炎支原体灭活疫苗免疫和自然感染的血清体液免疫显性蛋白ELISA方法的建立将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液原液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被,以PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉封闭,分别与11份Mhp恢复期血清和7份Mhp灭活疫苗高免血清反应,通过对血清(Mhp恢复期血清和Mhp灭活疫苗高免血清)和二抗稀释度进行优化,确定将血清按照1:500稀释、HRP标记兔抗猪IgG酶标二抗按照1:20 000稀释作为最佳工作浓度,建立了鉴定区分猪肺炎支原体灭活疫苗免疫和自然感染血清体液免疫显性蛋白的ELISA方法。4鉴定区分猪肺炎支原体灭活疫苗免疫和自然感染的血清体液免疫显性蛋白的筛选鉴定用已经筛选到的10个Mhp血清体液免疫显性蛋白的重组菌裂解液原液和GST工程菌裂解液原液包被谷胱甘肽板,PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉进行封闭,分别将11份Mhp恢复期血清和7份Mhp灭活疫苗高免血清按1:500稀释、HRP标记兔抗猪IgG酶标二抗按1:20 000稀释,进行ELISA反应。最终鉴定出1个区分猪肺炎支原体灭活疫苗免疫和自然感染的血清体液免疫显性蛋白Mhp336,从而为猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的研发提供抗原靶标。
【图文】：

重组质粒,琼脂糖,融合蛋白,蛋白

质粒的双酶切鉴定inant plasmid pGEX-6P-1-mhp366 by double enzymeested with BamH Ι and Xho Ι. GST 蛋白的原核表达与纯化菌经 1 mmol/L IPTG 诱导后，超声破 SDS-PAGE 电泳后可见在 90 kDa 和）。90 kDa 处为 GST 与 Mhp366 融合为 GST 蛋白。融合蛋白经 PreScission图 2，Lane 2、3、4、5），比预期蛋琼脂糖珠-融合蛋白复合物中仍有未GST 蛋白和 46 kDa 的 PreScission Pro特异结合在谷胱甘肽琼脂糖珠的杂蛋

酶切图,重组蛋白表达,阴性,裂解液

重组蛋白表达纯化及酶切结果 protein GST-Mhp366 was purified by Glutathione SepharoseTM4B and dn molecular weight marker; 1: the supernatant was harvested after the cleally washed three times with PBS; 6: the remaining bead sample after digesISA 反应条件的确定原包被浓度的选择366 和 GST 细菌裂解液分别按原液、1:5、1:10 比例稀 7 份 Mhp 阴性血清反应，分别计算在各个抗原包细菌裂解液和 GST 细菌裂解液与每份阴性血清反应和标准差（SD）（表 5）。浓度包被时，，GST-Mhp366 细菌裂解液和 GST 细菌裂解液分值之差及相应的 X、SD 和 X+2SDerence of OD630value, X, SD and X+2SD that the GST-Mhp366 lh different concentration were reacted with 7 negative sera阴性阴性阴性阴性阴性阴性平均
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.797

【参考文献】