日本血吸虫正常发育雌虫与发育阻遏雌虫差异表达蛋白分析

发布时间：2020-06-01 10:09

【摘要】：血吸虫病是由血吸虫感染引起的,造成宿主严重病理性损害的人畜共患寄生虫病。日本血吸虫尾蚴感染宿主,进入宿主体内发育为成虫,血吸虫成虫以合抱形式存在,雌虫只有与雄虫合抱才能达到性成熟,发育正常。正常发育雌虫所产虫卵堆积在肝门静脉和肠系膜静脉,虫卵分泌的物质会引起宿主肉芽肿反应,对宿主造成严重的病理损害,排出体外又会造成疾病的再传播;而未与雄虫合抱的雌虫呈发育阻遏状态,不能正常产卵,因此既不会对宿主造成严重危害,也不会造成血吸虫病的传播。本研究利用iTRAQ技术结合质谱分析了18 d、21 d、23 d和25 d的正常发育雌虫和发育阻遏雌虫的蛋白表达,共鉴定到了19423条肽段,3953个蛋白质,差异分析发现18d正常发育雌虫与发育阻遏雌虫差异表达蛋白632个,21d差异表达蛋白589个,23d差异表达蛋白705个,25d差异表达蛋白909个。MRM技术被用来验证iTRAQ蛋白质组学差异表达分析的结果,MRM结果表明iTRAQ结果可靠。对差异蛋白质组结果进行了生物信息学分析,GO功能注释和KEGG通路分析的结果表明随着血吸虫的生长发育,在正常发育雌虫中较多的蛋白参与合成与代谢,翻译修饰,蛋白质折叠和代谢进程,在发育阻遏雌虫中较多的蛋白参与生物体运动和细胞周期,氧化还原反应,能量代谢。参与生殖进程的蛋白在正常发育雌虫中表达上调较多,参与解毒相关的差异蛋白在18d和21d的发育阻遏雌虫中只表达下调,在23d和25d时,参与解毒的差异蛋白总数增多。在血吸虫四个生长发育时间点中,参与结合和催化活性、翻译调节活性和抗氧化活性的差异表达蛋白在正常发育雌虫中上调较多。参与KEGG通路的的差异表达蛋白在四个生长发育时间点均参与合成和代谢通路最多,且均在正常发育雌虫中表达上调较多。对差异蛋白进行亚细胞定位分析,差异蛋白主要定位于细胞质,细胞外基质,细胞核和线粒体。本研究克隆并融合表达了SjLwr基因(Gene Bank登录号:CAX77005.1),基因序列为501bp,编码137个氨基酸。Western blot结果表明该蛋白具有良好的反应原性。利用His镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,免疫组化表明该蛋白定位于虫体体表和体内。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,SjLwr基因在血吸虫的不同检测时间点皆表达,在感染后14d表达量最高,随后逐渐下降并趋于稳定;其在雄虫体内的表达相对稳定,雌虫体内表达均高于雄虫;25d发育阻遏雌虫中的表达高于25d正常发育雌虫。通过体内RNAi实验成功筛选出干扰效果较好的S2 siRNA,并使用S2 siRNA进行体内长期干扰实验。qRT-PCR检测干扰效果,发现RNA干扰明显抑制了SjLwr基因的表达。对长期干扰虫体产卵及卵胚孵化率进行统计分析发现,S2组较NC组减虫率达51.37%(P0.05),每只雌虫肝脏虫卵负荷的贡献率下降15.37%(P0.05),宿主肝脏荷卵数减少达43.98%(P0.05),卵胚孵化率减少达64.95%(P0.01)。电镜观察发现,与NC组相比,S2 siRNA组虫体体被上白色点状突出物和泡状突出物增多,体被组织排列不整齐,且部分组织有破损;雌虫卵黄细胞卵黄滴和脂滴减少,细胞不饱满,细胞间隙增大。本研究中,利用iTRAQ技术结合质谱分析,获得不同时期正常发育雌虫和发育阻遏雌虫的蛋白表达信息,差异表达蛋白参与了血吸虫雌虫生殖发育的不同进程;差异表达蛋白SjLwr初步的生物学功能研究也为今后进一步研究该蛋白在血吸虫雌虫生殖发育中的作用提供了理论依据。
【图文】：

图 2-1 光学显微镜观察雌虫形态。21 d，23 d，25 d 正常发育雌虫；BDFH：18 d，21 d，23 d，25 d 发育育雌虫；E，卵；Ov，卵巢；Vt，卵黄腺；Ic，肠管；Vd，卵黄管。长为 1 mm。Figure 2-1 Morphological observation of female worm. d, 23 d and 25 d MF; BDFH: 18 d, 21 d, 23 d and 25 d SF. I: 25 d MF; E, vitelline gland; Ic, intestinal canal; Vd, vitelline ducts. The scale length is

图 2-2 SDS-PAGE 电泳图。Figure 2-2 The results of SDS-PAGE.解肽段浓度测定 280 吸收值评估酶解后肽段的相对浓度，吸光度值转换为品浓度。酶解后测定蛋白质浓度如表 2-4 所示。表 2-4 酶解后测定蛋白质浓度Table 2-4 Determination of protein concentration after enzymatic hydrolys样品名 浓度(μg/uL) 体积(μL) 蛋白总量(μg18 d MF 0.57 330.00 188.0721 d MF 0.57 330.00 188.6723 d MF 0.61 330.00 200.5125 d MF 0.91 330.00 300.98
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.735

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本文编号：2691324