应用CRISPR-Cas9系统对兔GDF8基因敲除的初步研究
发布时间：2021-03-09 13:11
生长分化因子 8(growth differentiation factor 8,GDF-8)又称肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是一种肌肉生长负反馈因子,主要在骨骼肌中高水平表达。GDF-8基因自然或人工突变的动物都表现出骨骼肌过度肥大的现象,肌肉含量显著增加,对肉畜养殖业具有重大的经济价值。基因编辑技术是研究基因功能的一种重要方法。近年来,CRISPR-Cas系统凭借其灵活、便捷、快速、耗费低的特点广泛应用在多种动植物的基因编辑中。CRISPR-Cas系统是来源于古细菌中的一种核酸酶与非编码小RNA构成的复合物,其主要依靠单链向导RNA(SgRNA)结合在基因上的特定序列,从而实现对靶向DNA序列位点实行切割,引起DNA双链断裂(DSBs),继而在细胞自身DNA修复机制的作用下,完成基因编辑。本研究运用CRISPR-Cas9系统对加利福尼亚兔(简称兔)GDF8基因进行基因编辑。首先在外源基因上对选定的位点进行编辑效率的验证,其次在兔成纤维细胞上进行编辑效率的验证,然后在兔受精卵注射Cas9mRNA和SgRNA,培养至囊胚期进行编辑效率的验证,最后将显微注射过的受精卵移植回母兔输卵管,以期获得基因编辑兔。主要研究结果如下:(1)成功构建了由hSpCas9真核表达载体和gRNA真核表达载体组成的基因打靶系统,且通过在细胞和胚胎层面的检测验证了其可以准确的对靶位点进行基因编辑。(2)在兔GDF8基因上成功筛选到了两个可以高效结合gRNA真核表达载体的靶位点E1和E2。通过RGS-CR报告载体在HEK293T细胞转染实验中的检测及流式细胞仪的分析,两个gRNA位点均可高效率的介导形成DSBs,其中gRNAE1的效率达到了 64.0%,gRNAE2的效率略高于E1,达到了 64.4%。(3)成功分离到了兔原代成纤维细胞,并运用构建的打靶系统在兔成纤维细胞上实现了对GDF8基因的编辑。T7E1酶切鉴定结果表示gRNAE1在成纤维细胞上的编辑效率为27.1%,gRNAE2在成纤维细胞上的基因编辑效率为7.4%。测序结果表明gRNAE1的编辑效率达到了 45.3%,gRNAE2在兔成纤维细胞上的基因编辑效率为25.0%(4)运用构建的打靶系统在兔一细胞期胚胎上成功实现了对GDF8基因的编辑。选用双位点基因打靶的策略,通过体外转录获得hspCas9mRNA和sgRNA,然后按100:50ng/μL的浓度比显微注射到兔一细胞期胚胎中,并培养至囊胚期,通过巢式PCR扩增进行测序验证,测序结果表明,gRNAE1和gRNAE2共同打靶在兔内源胚胎上的编辑效率达到了 20.0%。(5)运用构建的打靶系统生产转基因兔,本次一共移植了 28枚胚胎至两只母兔,十天后通过触诊判断两只均妊娠,其中一只在孕期21天时流产,流出了 6只死胎,另一只在孕期23天时流产,流出3头死胎。剪取这九只死胎的大腿肌肉组织,提取组织基因组,进行PCR扩增以及测序验证。测序结果表明,未在靶位点检测到基因突变的现象。
【图文】：
并且推测肌肉生长抑制素的氨基酸序列具有推定的氨基末端信号序列，ＴＧＦ－Ｐ逡逑前肽结构域，，ＲＸＸＲ蛋白水解加工位点，ＴＧＦ－Ｐ结构域和１２个保守的半胱氨酸逡逑残基，且肌肉生长抑制素基因在四种检查的１０种组织和器官中表达￥（图１－１）。逡逑ＧＤＦ８Ｇ＾ｍ—逦逦—逡逑Ｉ邋＼逦／逦＼邋Ｚ邋＼逡逑！、、、、、、、丨、、、、、、、／邋丨逡逑ＭＳＴＮ邋Ｊ逡逑图１－１邋ＧＤＦ８基因及ＭＳＴＮ蛋白结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＧＤＦ８邋ｇｅｎｅ邋ａｎｄ邋ＭＳＴＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２基因编辑技术研究进展逡逑在基因功能研宄领域，基因编辑技术是一项重要的研[偡椒ā＝昀矗义希茫遥剩樱校遥茫幔螅瓜低称窘杵淞榛睢⒈憬荨⒖焖佟⒑姆训偷奶氐愎惴河τ迷诙嘀侄插义衔锏幕虮嗉小Ｔ冢茫遥桑樱校遥茫幔螅瓜低秤糜诨虮嗉埃恐负怂崦福ǎ椋睿沐义希妫椋睿纾澹蝈澹睿酰悖欤澹幔螅澹螅冢疲危螅┖妥技せ钛вσ蜃雍怂崦福ǎ簦颍幔睿螅悖颍椋穑簦椋铮铄澹幔悖簦椋觯幔簦铮颍欤椋耄邋义希澹妫妫澹悖簦铮蝈澹睿酰悖欤澹幔螅澹螅澹裕粒蹋牛危螅┦侵饕幕虮嗉ぞ摺Ｕ饬街址椒ň览涤诘鞍资跺义媳鸢形坏悖虼耍杂诓煌陌形坏阈枰杓撇煌牡鞍祝匝橹芷诔ぃ一ㄥ义戏呀细摺Ｏ喽杂谡饬街只虮嗉椒ǎ茫遥桑樱校遥茫幔螅辜际踉蛞揽康氖牵樱纾遥危潦跺义媳鸢形坏
本文编号：2691896
【图文】：
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【学位授予单位】：广西大学广西壮族自治区211工程院校
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【页数】：66
文章目录
摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章 文献综述
1 动物GDF8基因研究进展
2 基因编辑技术研究进展
2.1 锌指核酸酶技术
2.2 类转录激活因子样效应物核酸酶技术
2.3 CRISPR/Cas系统的研究进展
2.3.1 CRISPR/Cas系统的研究历史
2.3.2 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用
2.3.3 在动物遗传育种方面的应用
2.3.4 在疾病治疗方面的应用
第二章 CRISPR/Cas9系统介导的兔GDF8基因编辑研究
前言
1 实验材料与仪器设备
2 主要溶液的配制
2.1 CCM溶液的配制
2.2 DMEM液的配制
2.3 0.25%胰蛋白酶消化液的配制
2.4 PBS液的配制
3 实验方法
3.1 构建gRNA真核表达载体并筛选高活性的gRNA结合位点
3.1.1 设计gRNA靶位点并构建gRNA真核表达载体
3.1.2 筛选具有高活性的gRNA靶位点
3.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑系统在兔成纤维细胞上的验证
3.2.1 电穿孔介导的DNA转染兔的成纤维细胞
3.2.2 提取转染后成纤维细胞的基因组
3.2.3 鉴定基因编辑细胞GDF8的基因型
3.3 体外转录获得hSpCas9 mRNA及sgNA
3.4 兔的超数排卵及胚胎收集
3.5 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑系统在胚胎水平上的验证
3.6 GDF8基因敲除兔的生产
3.7 CRISPR/Cas9介导的仔兔基因突变的检测
4 结果与分析
4.1 兔GDF8基因编辑位点的筛选
4.2 兔GDF8基因编辑载体构建
4.3 兔GDF8基因编辑载体细胞转染及检测
4.4 兔GDF8基因编辑载体的流式细胞检测
4.5 兔胎儿成纤维细胞的培养和转染检测
4.6 CRISPR/Cas9介导的兔成纤维细胞GDF8的基因编辑
4.7 CRISPR/Cas9介导的兔胚胎GDF8基因编辑
4.8 GDF8基因编辑兔的生产与鉴定
5 讨论
6 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文及专利
本文编号：2691896
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2691896.html
