【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的严重危害养猪业的高度接触性传染病,其主要特征为母猪繁殖障碍、新生仔猪死亡率升高以及各年龄猪呼吸道症状。PRRS于1995年传入我国,现已成为现代化养猪场最重要的传染病,特别是2006年以来流行的高致病性PRRSV给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前PRRS主要靠弱毒活疫苗免疫进行控制,尽管对同源毒株感染的免疫保护效果较好,但对异源毒株感染的免疫保护效果存在争议,而且存在毒力返强和病毒扩散风险。PRRSV是变异最快的RNA病毒之一,具有复杂的感染及免疫逃逸机制,新型疫苗研制面临巨大挑战,迫切需要研究抗病毒感染的新策略。PRRSV主要感染猪单核-巨噬细胞系统,参与感染的病毒受体主要有两个,其中CD163是病毒感染巨噬细胞的核心受体,其第5-9个清道夫受体半胱氨酸富含结构域(SRCR5-9)含PRRSV结合区;唾液酸粘附素(Sn)辅助病毒吸附和进入靶细胞,其前4个免疫球蛋白样结构域(Sn4D)为PRRSV结合区。本课题组的前期研究结果证明,重组腺病毒表达的Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游离受体能阻断PRRSV感染猪肺巨噬细胞(PAM),两个游离受体具有抗感染协同作用。然而,这些重组腺病毒能否在猪体内有效表达游离受体及其能否抵抗PRRSV感染有待进一步研究。为此,本课题开展表达游离受体重组腺病毒的体内抗PRRSV感染研究。1.PRRSV游离受体捕捉蛋白表达、纯化和活性检测链球菌G蛋白(SPG)是IgG结合蛋白,其C2结构域能与多种哺乳动物IgGFc片段结合。类弹性蛋白多肽(ELP)是新型重组蛋白纯化标签,具有温度敏感的可逆相变特性,其融合蛋白可用温控离心法纯化。为了建立Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游离受体捕捉与检测方法,本研究构建SPG C2与ELP编码序列融合表达载体pELP-C2,将其转化大肠杆菌BLR(DE3),用IPTG诱导ELP-C2融合蛋白表达,对可溶性融合蛋白表达及其纯化的可逆相变循环(ITC)条件进行了优化。研究结果显示:37℃条件下重组菌能表达可溶融合蛋白ELP-C2,但表达水平较低;0.lmM IPTG足以诱导融合蛋白表达,表达水平具有温度和时间依赖性,26℃诱导30h的表达水平最高;离心沉淀ELP-C2融合蛋白的ITC条件为32℃和3M NaC1,两轮ITC纯化的ELP-C2融合蛋白纯度大于90%;Western-blot鉴定结果显示ELP-C2融合蛋白能与猪等哺乳动物IgG和鸡IgY结合,为建立Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游离受体浓缩与检测方法奠定了基础。2.PRRSV游离受体检测方法建立和体内表达检测鉴于ELP-C2融合蛋白也能与鸡IgY结合,本研究先以容易获得的鸡IgY为对象摸索利用ELP-C2融合蛋白浓缩及纯化Ig的条件。试验结果显示,ELP-C2能从粗制卵黄抗体中有效捕捉IgY,其最佳结合条件为16℃和125μg/mL融合蛋白,IgY能从蛋白复合物中有效洗脱,最佳洗脱条件为用pH 9.5的0.1M甘氨酸在28℃洗脱5min。在此结合和洗脱条件下,利用ELP-C2融合蛋白能从重组腺病毒感染PK-15细胞培养中浓缩和纯化Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游离受体,其纯度分别为93.1%和94.3%。以纯化的Sn4D-Fc为抗原,以小鼠抗猪Sn免疫血清为包被抗体,以生物素标记猪Sn多克隆抗体为第二抗体,建立了定量检测猪Sn的双抗体夹心ELISA方法,检测灵敏度为0.4ng/mL。最后分别将重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59-Fc注射仔猪,定期采集猪血分离血清,经ELP-C2捕捉浓缩后,分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测Sn4D-Fc和SRCR59-FC融合蛋白表达。结果显示重组腺病毒接种猪能分泌表达两种游离受体,表达持续15天左右。3.PRRSV接触感染仔猪模型建立为了模拟PRRSV自然感染和用于游离受体攻毒保护效果评价,将易感仔猪与JXA1株PRRSV人工感染仔猪在隔离器中进行同居饲养,每日观察记录体温变化和临床症状,定期采集血清和粪便样品,用荧光定量RT-PCR检测病毒血症和粪便排毒水平;对病死猪和试验结束扑杀猪进行剖检和病理学检查,用荧光定量RT-PCR检测病毒载量和组织分布。结果显示:接触感染仔猪于同居后第4天出现体温升高,第5天出现PRRS症状,分别较人工接种猪推迟2和3天;第7天出现PRRS典型症状,症状计分与人工接种猪接近;第3天起为血清检测PRRSV阳性,第10天病毒血症上升至较高水平(8.6 logl0/mL);第5天起为粪便检测PRRSV阳性,第7天起粪便排毒上升至较高水平(3.9 logl0/0.lg);3头接触感染仔猪分别于同居后第12和13天死亡,较人工接种猪推迟1-2天;接触感染病死仔猪的主要器官病毒载量以及大体和显微病理变化与人工接种病死猪相似。这些研究结果表明,建立的接触感染仔猪模型可用于PRRS疫苗免疫效果评价。4.游离受体对JXA1株PRRSV感染的阻断作用为了评价游离受体的攻毒保护作用,根据血清RT-PCR和ELISA检测结果选择PRRSV易感仔猪9头,分别肌肉注射4×109TCID50重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc(n=3)、rAd-SRCR59-Fc(n=3)和 rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc(n=3)。在注射后第 5 天,分组与JXA1株PRRSV人工感染猪同居饲养,定期观察临床症状,统计发病死亡情况,采集血样和粪样进行PRRSV定量检测,对病死猪进行病理解剖和病毒定量检测。结果与感染对照组(n=3)相比,rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc 和 rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射组体温升高时间分别推迟2、3和5天,临床症状出现时间分别推迟3、3和4天;感染组仔猪于第12、13天全部死亡,rAd-Sn4D-Fc注射组分别于第23、24、25日死亡,rAd-SRCR59-Fc注射组第23天死亡1头,死亡猪具有PRRS典型病变,而rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射组无猪死亡;将死亡猪和幸存猪扑杀后剖检,rAd-Sn4D-Fc注射组仔猪肺脏水肿、出血,有明显间质性肺炎,rAd-SRCR59-Fc和rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射组肺脏无明显肉眼病变,仅见少量坏死灶,病理切片显示肺泡壁轻微增厚;同居感染后病毒血症和粪便排毒检出时间分别比感染组推迟2、2、4天和2、2、5天;重组腺病毒注射组仔猪各器官病毒载量均低于感染组,并且rAd-Sn4D-Fc + rAd-SRCR59-Fc注射组最低,其次为rAd-SRCR59-Fc注射组。这些研究数据表明,重组腺病毒表达的Sn和CD163游离受体对高致病PRRSV具有不同程度抗感染作用,Sn游离受体的抗病毒感染作用较弱,CD163游离受体的抗病毒感染作用较强,两者具有抗感染协同作用,这与先前报道的体外研究结果一致,也与CD163是PRRSV主要受体、Sn是PRRSV次要受体的结论相符。5.游离受体对不同毒株PRRSV感染的阻断作用为了验证两种游离受体对不同毒株PRRSV的感染阻断作用,选择PRRSV易感仔猪6头,肌肉注射重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc(各2×109TCID50)。在注射后第5天,每组3头分别与高致病PRRSV临床分离株SH1705和JS07感染猪同居饲养,按照上述方法进行抗病毒效果评价。结果与JS07和SH1705株感染对照组相比,rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射组仔猪体温升高时间分别推迟4天和8天;临床症状出现时间均推迟2天,第7-17天rAd注射组症状计分显著低于JS07感染组(P0.05),第7-20天rAd注射组症状计分显著低于SH1705感染组(P0.05);JS07和SH1705感染组均有1头仔猪死亡,死亡猪肺脏红肿、出血,呈现典型间质性肺炎,rAd注射组无死亡,扑杀后肺部无明显病变;rAd注射组的病毒血症检出时间比JS07和SH1705感染组均推迟4天;rAd注射组的粪便排毒检出时间比JS07和SH1705感染组均推迟3天;rAd注射组仔猪脾、肺和淋巴结的病毒载量显著低于JS07感染组(P0.05),脾、肺、肾和淋巴结的病毒载量显著低于SH1705感染组(P0.05)。这些研究资料表明,联合注射表达Sn和CD163游离受体的重组腺病毒能有效阻断不同PRRSV毒株感染,可以作为PRRS预防或治疗性疫苗进一步研究。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
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本文编号：
2692077
