氧化苦参碱体外抗犬博卡病毒（MVC）感染的作用研究

发布时间：2020-06-02 06:12

【摘要】：目的:犬博卡病毒(Minute virus of canines,MVC)是一种体积小,无包膜、能够自主复制的单链DNA(ssDNA)病毒,是犬类多种疾病发生的病原体。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)作为苦参的主要有效成分之一,具有抗炎抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常和抗纤维化等功效。尤其在抗病毒方面,对于多种病毒都具有抵抗作用。本研究中,我们主要通过观察氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)对犬博卡病毒(MVC)感染引起的沃尔特里德犬(Walter Reed canine cell/3873D,WRD)细胞凋亡、细胞周期与活力的变化以及对病毒基因的复制和表达、病毒颗粒形成的影响,以此来探究OMT体外抗犬博卡病毒的作用。方法:首先,以0.5mM至20mM(mmol/L)系列浓度的OMT孵育WRD细胞72h,采用CCK-8法确定氧化苦参碱使用的安全剂量,并以MVC感染WRD细胞建立感染模型,在安全剂量的干预下检测氧化苦参碱对感染细胞活力的影响;其次,以4mM(安全剂量浓度)的OMT对感染的细胞进行干预,一方面采用Southern blot检测氧化苦参碱对病毒基因组DNA复制的影响,同时分别采用Western blot和qRT-PCR技术对病毒基因NS1、NP1和VP2的蛋白以及mRNA表达水平进行检测,比较OMT干预组与病毒组,观察氧化苦参碱对病毒基因表达的影响,另一方面采用免疫荧光法观察病毒颗粒的形成;与此同时,流式细胞术和Western blot检测细胞周期、细胞凋亡的变化,以及凋亡相关基因Caspase-3的激活和Bcl-2的表达。结果:1.病毒感染复数一定(MOI:10)时感染细胞,不同OMT浓度(0.5mM至20mM)进行干预,与感染组相比,干预组中感染细胞的活力值明显升高(~(**)P0.01);病毒感染复数不同(MOI:2.5、5、10、20、40、80),以一定浓度的OMT(安全剂量4mM)对感染细胞进行干预,与感染组相比,随着病毒感染复数不断增大,细胞活力降低(~*P0.05)。2.与感染组相比,加入OMT进行干预后,病毒基因组DNA的复制和病毒基因NS1、VP2和NP1表达水平明显降低(~*P0.05),病毒颗粒的形成明显减少。3.相较于感染组,在感染早期,OMT干预组中S期阻滞明显缩短,在感染后期,细胞凋亡明显减少(~(**)P0.01)。4.与感染组相比,加入OMT进行干预后,凋亡因子Caspase-3的激活产物的表达降低(~*P0.05),抗凋亡因子Bcl-2的表达增强(~(**)P0.01)。结论:1.OMT能够显著提高MVC感染靶细胞的细胞活力,使细胞凋亡减少并保护细胞,发挥抗MVC活性的作用。2.OMT能够抑制病毒基因组DNA的复制、病毒基因的表达、病毒颗粒的形成以及缩短感染早期S期的阻滞。3.OMT减少感染细胞的凋亡,可能与抑制凋亡因子Caspase-3的激活,增强抗凋亡因子Bcl-2的表达有关。
【图文】：

细胞活力,半数致死浓度,学位论文,抗病毒

士学位论文结果碱使用安全剂量的确定浓度为 0.5、1、2、4、5、8、10、15、20 mmol/L（mM）的氧育 72 h 后，采用 CCK-8 实验观察细胞的增殖情况，结果显示， 0.5、1、2、4 和 5mM 时细胞活力均高于正常对照组，说明 5m碱溶液为安全使用剂量；当浓度升高到 10mM 时，细胞活力值低了半数致死浓度（CC50）。因此，我们选取 10mM 以下不同浓度抗病毒实验的研究。

活力变化,细胞的,感染复数,细胞活力

宁夏医科大学硕士学位论文结果减弱，表明 4mM 浓度以下 OMT 具有抗病毒作用（图 2A）。因此，我们确定 4mM 氧化苦参碱浓度作为抗病毒的最佳安全剂量，在后续的实验中我们选取 4mM 的 OMT 浓度进行研究。为了观察 OMT 对不同 MOI 病毒感染细胞后细胞活力变化的影响，以不同感染复数的病毒液（MOI: 2.5、5、10、20、40、80）感染细胞，安全剂量浓度的 OMT（4mM）进行干预。结果发现，与感染组相比，病毒感染复数值为 5 和 10 时，MVC/OMT 干预组的细胞活力升高（**P<0.01），，随着 MVC 感染复数的增加，OMT 抑制病毒能力减弱（*P<0.05）（图 2B）。表明 OMT 对低感染复数的病毒有很好的抑制作用，增强感染细胞的细胞活力，对靶细胞产生保护作用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S853.7

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