PCV2感染与免疫血清IgG、IgM抗体变化特征研究及其ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-06-02 05:48

【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染会引起机体免疫功能紊乱、免疫抑制,多种病原继发感染和混合感染,给养猪业造成极大的损失。PCV2持续性感染导致猪群的血清抗体阳性率居高不下,接种疫苗产生的抗体与自然感染产生的抗体无法有效区分,这是目前疫苗免疫防控面临的最大挑战。鉴于此,本研究通过监测猪群中IgG和IgM抗体的动态变化规律,发现PCV2特异性IgM抗体的存在时间和存在状态在区分疫苗免疫和病毒感染方面发挥重要作用,基于此,分别建立了基于SPG的检测PCV2 IgG抗体的捕获ELISA和以抗猪IgM多抗为捕获抗原的检测PCV2 IgM抗体的捕获ELISA方法,综合两种抗体诊断方法的判定结果可为判断猪群感染状态和疫苗接种时机提供科学指导。研究内容可分为以下三个部分:1.分析PCV2感染和免疫后猪群产生的IgG和IgM抗体消长规律利用PCV2商品化灭活疫苗和细胞分离毒株分别免疫和感染抗体阴性猪,接种后定期采集外周血并分离血清,进口试剂盒INGEZIM IgG/IgM Kit检测血清样品。通过监测抗体的消长变化,发现免疫和感染后IgM抗体首先产生,随后转变为IgG抗体,且持续存在;人工感染PCV2细胞毒产生的IgM存在时间为20-30 d,自然感染(感染组的阳性对照)产生的IgM持续55 d,而接种灭活疫苗的免疫组IgM的存在时间不超过14 d。PCV2 IgM抗体产生特点可以优化免疫程序,区分病毒感染和疫苗免疫,首先免疫前应该避开IgM抗体阳性期;免疫后若IgM抗体变为阴性,在下次接种疫苗之前若检测结果为阳性,那么必定出现了新一轮的PCV2感染,此时不建议追加免疫。2.基于SPG建立检测PCV2 IgG的捕获ELISA通过比较SPA、SPG和PPL三种免疫球蛋白结合蛋白作为捕获抗原、HRP标记的PCV2 Cap作为二抗的捕获法ELISA,确定SPG为包被抗原,优化反应条件,绘制ROC曲线确定临界值(cut-off point,cut-off值)为0.61,此时对应的敏感性和特异性分别为93.9%和90.3%。187例临床样本的检测结果显示,该方法与商业化的INGEZIM Circovirus IgG Kit的总符合率为96.23%。3.建立捕获ELISA检测PCV2 IgM抗体以兔抗猪native IgM高免血清做包被抗原,HRP标记的R2346作为二抗,建立检测猪抗PCV2IgM抗体的ELISA方法。优化该方法的最佳反应条件后,绘制ROC曲线判定cut-off值为0.492,对应的敏感性和特异性分别为96.7%和97.2%;检测田间血清样品IgM与INGEZIM IgM Kit试剂盒符合率为92.7%。本研究分别建立检测PCV2 IgG和IgM抗体的捕获ELISA,为优化疫苗免疫程序、PCV2的早期快速诊断和区分病毒感染和疫苗免疫提供了简单有效的途径,为进一步控制PCV2在猪场中的流行传播提供了可靠依据。
【图文】：

图 2.1 部分标准血清的 IFA 结果Fig 2.1 Partial reference serum immunofluorescence results3.2.2 PCV2 Cap 蛋白的表达及鉴定通过SDA-PAGE证实PCV2 Cap重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，镍离子柱纯化效果较好（图2.2）。Western blot 显示抗体能够识别纯化的 Cap 蛋白，说明具有反应原性（图 2.2）。

图 2.2 PCV2 Cap 蛋白的 SDS-PEGE 和 Western Blot 分析Fig 2.2 SDS-PAGE and Western Blot analysis of PCV2 Cap0 kDa)；1 和 2：IPTG 未诱导和诱导后的重组 PCV2 Cap；3：t。Marker(10-170 kDa); Line1 and Line2: Uninduced and IPTG-induap; Lane 4: Western Blot of purified proteins.件的优化明，无论 OD450还是 P/N 值均显示 SPG 为最佳捕获875 ng(1:800)，血清的最佳稀释度为 1:80（图 2.3 和图 0.5 h、1 h 和 2 h，结果显示，随着培养时间的延长，表 2.1）。Akerstrom 等人曾报道 SPG 与 IgG 在 30-4使 16.5 h 后，它仍在缓慢上升(Akerstrom and Bjorck,为 1 h（图 2.5a）。此外，缓冲溶液的 pH 值对 SPG 结合而，这一结论与以前的报告不一致(Akerstrom and B，，这表明 SPG 能够很好地适应反应环境的酸碱度。因
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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本文编号：2692703